山东地方鸡种NR3C2基因多态性检测及其与繁殖性状的关联分析

周艳雷秋霞韩海霞李福伟刘杰刘玮王杰汤存伟李大鹏曹顶国

(1.山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250100；2.山东省家禽育种工程技术研究中心，山东 济南 250100；3.山东益嘉种禽有限公司，山东 临沂 276000)

盐皮质激素受体(MR，NR3C2)是核受体超家族的一员，该超家族是一类配体依赖性转录因子，在多细胞生物中是含量最丰富的几大类转录因子超家族之一[1]。核受体的一般途径为配体与相应核受体结合诱导受体的二聚化并增强其与特定DNA序列的结合[2]，从而激活或抑制下游基因的表达。NR3C2基因的表达范围很广，在肾脏极化的紧密上皮、人类和鼠的大肠、气道、汗腺、唾液腺、肝脏、内皮的上皮组织[3]、脂肪组织[4]及单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞、番鸭的肝、肾、脑、腿、胆和胸[5]中均有表达。NR3C2分布的广泛性揭示了其功能的多样性，目前研究最多的是与人类疫病相关的功能，比如肾细胞癌[6]、胰腺癌[7]、肝癌[8]等肿瘤发生、高血压[9]、1型假性醛固酮减少症[10]、高原肺水肿[11]、慢性中心性浆液性脉络膜视网膜病变[12]等。此外NR3C2还被发现与人的行为异常[13]及精神分裂[14，15]等有关，近来也有研究表明NR3C2参与脂类代谢，在脂肪性肥胖[16]中发挥作用。在动物中的研究表明，NR3C2的表达水平在番鸭不同行为状态下存在差异[5]；其单核苷酸变异与猪的肥胖相关[17]；对内洛尔牛进行研究表明，其单倍型与肉色、烹饪损失、肌肉糖原含量和血浆促肾上腺皮质激素浓度等肉质性状相关[18]；在鸡上目前未发现有相关研究报道。本课题组前期研究发现NR3C2基因在鸡卵巢颗粒细胞中高表达(未发表)，因此猜测该基因在鸡繁殖性能中可能发挥重要作用。

鸡NR3C2基因位于4号染色体，共有8个外显子组成，编码981个氨基酸。本研究以山东地方鸡种和高产蛋鸡为素材，采用直接测序和PCRRFLP技术对该基因进行SNP扫描，分析多态位点与鸡繁殖性状的相关性，以期挖掘该基因与山东地方鸡繁殖性状密切相关的分子标记，为地方鸡种遗传改良和创新利用奠定科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

济宁百日鸡396只、汶上芦花鸡522只、莱芜黑鸡392只、海兰褐蛋鸡206只，均来自山东省地方鸡品种资源活体基因库。所有试验群体均为同批入孵，饲养条件一致，随机采样，翅静脉采血，ACD抗凝，-20℃保存。采用常规酚/氯仿法提取鸡血液DNA。莱芜黑鸡单笼饲养，专人负责个体产蛋记录。

1.2 突变位点及引物信息

根据鸡NR3C2基因(GenBank登录号NC_052535)的DNA序列，设计1对引物，引物序列为F:5′-AGACAGACAGGGATAG-3′，R:5′-GAGGACACTGAGTTAA-3′，扩增目的片段长度771 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 PCR扩增与PCR-RFLP分析

PCR反应体系(15 μL):2×TaqPCR MasterMix 7.5 μL，ddH2O 5.6 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.45 μL，基因组DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR扩增程序:94℃3 min；94℃30 s，48.1℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃4 min。

PCR-RFLP反应体系(15 μL):TaqⅠ(10U/μL)0.5 μL，10×BufferTaqⅠ1 μL，PCR产物8 μL，ddH2O 5.5 μL，65℃水浴过夜。

酶切产物检测:120 V、1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，分析酶切产物基因型。

1.4 序列分析

每个基因型取两个不同个体的PCR产物于济南力戈科技有限公司进行克隆测序。

1.5 关联分析

采用SAS 8.1统计软件包的GLM程序进行基因型与性状(产蛋数、开产日龄)的关联分析。统计分析模型为yi＝μ+Gi+ei，其中yi代表性状表型值，μ为性状群体均值，Gi代表基因型效应值，ei为随机残差。

不同基因型间的比较分析用最小二乘法，试验数据用最小二乘均值±标准误(LSM±SE)表示，显著水平设定P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 基因型判定

由图1可知，NR3C2基因3 714多态位点经TaqⅠ限制性内切酶酶切后在山东省3个地方鸡种和引进高产品种中均表现出3种基因型:GG(417、51、303 bp)，AA(468、303 bp)和GA(468、417、303、51 bp)。

图1 鸡NR3C2基因3 714多态位点酶切结果

2.2 序列分析

测序结果表明(图2)，鸡NR3C2基因3 714位点是一个G→A的突变，该突变位点位于外显子1内，包含TaqⅠ限制性内切酶的识别序列“T/CGA”，其中“G”不发生突变即“T/CGA”类型记做“GG”；“G”突变为“A”，即“T/CAA”类型记做“AA”；GA为杂合型。

图2 鸡NR3C2基因3 714多态位点的序列分析(反向测序)

2.3 NR3C2基因3 714多态位点等位基因和基因型频率分布

3 714位点在济宁百日鸡、汶上芦花鸡和莱芜黑鸡3个地方鸡种中的优势基因型均为杂合型GA，频率约为50.00%，等位基因A和G的频率也接近平均分布。在高产蛋鸡海兰褐中的优势基因型为纯合型GG，频率为88.84%，优势等位基因G频率为93.93%(表1)。

表1 NR3C2基因3 714多态位点的基因型频率和等位基因频率

2.4 NR3C2基因3 714多态位点与产蛋性能的关联分析

在392只莱芜黑鸡群体中，对NR3C2基因3 714位点与4个繁殖性状进行关联分析和多重比较，结果见表2。

表2 NR3C2基因3 714多态位点各基因型与繁殖性能的关联分析

3 714位点与43W产蛋量(P＝0.0467)、44W产蛋量(P＝0.0486)和45W产蛋量(P＝0.0499)均显著相关。基因型GG个体的最大产蛋量与基因型GA个体间差异显著(P＜0.05)，而且该基因型在开产日龄性状上也表现出优势，GG基因型个体的开产日龄最早，比GA基因型个体平均早1.17 d。

3 讨论与结论

盐皮质激素受体基因功能非常广泛[3]，不仅维持水钠平衡，还与心血管重构、行为认知、脂肪代谢、脑缺血再灌注脑损伤[19]、认知障碍[20]、产后抑郁症[21]等病理生理反应有关。本研究发现鸡NR3C2基因3 714位点GG基因型在低繁殖力的3个山东省地方鸡种中表现为劣势基因型，而在高产蛋鸡海兰褐中表现为优势基因型，频率高达88.84%，等位基因G频率高达93.93%。济宁百日鸡、汶上芦花鸡和莱芜黑鸡均为山东省地方鸡种，与国外高产蛋鸡品种相比，繁殖力较低，这也是制约地方鸡种创新利用的瓶颈因素，而海兰褐蛋鸡是经过长期选择形成的商业化品系，近年来，基因组育种在其品系育成过程中更是发挥了重要作用，有益基因经过选育在群体内大量聚合，因此，结合品种特点初步推测GG基因型可能与高产蛋性状有关。

关联分析结果也表明该位点与莱芜黑鸡多个时期的产蛋量存在显著相关，GG基因型个体在开产日龄、43W产蛋量、44W产蛋量和45W产蛋量性状中均表现最优，且在其中3个性状上与GA基因型个体间差异显著，可以推断GG型与高繁殖性能相关，可以用于地方鸡种的育种。在地方鸡种选育过程中，可选择GG型个体留种，不但可以将开产日龄提前，还能提高总产蛋量，极大提升地方鸡种的繁殖性能，促进地方鸡种的创新利用，提高经济效益。

本研究采用PCR-RFLP方法在汶上芦花鸡、济宁百日鸡、莱芜黑鸡和海兰褐中检测到NR3C2基因3 714 nt处发生点突变G→A，基因型GG在3个地方鸡种中表现为劣势基因型，而在高产蛋鸡海兰褐中表现为优势基因型。关联分析结果表明3 714位点对43W产蛋量(P＝0.0467)、44W产蛋量(P＝0.0486)和45W产蛋量(P＝0.0499)均表现出显著相关，且GG基因型个体的开产日龄也最早，比GA基因型个体平均早1.17 d。GG基因型可以作为地方鸡种繁殖性状的分子标记。