红曲米发酵生产甘蔗果酒及其总酚和抗氧化性测定

2022-10-21郑美玲黄结刘梅芳李楠

食品工业 2022年9期

郑美玲，黄结，刘梅芳，李楠

1. 广西壮族自治区食品药品检验所（南宁 530001）；2. 广西大学生命科学与技术学院（南宁 530004）

甘蔗中含有大量糖分，可作为微生物生长的碳源，也是人类能量代谢的根源[1]。甘蔗中含铁元素较多，食用甘蔗能改善人体的缺铁性贫血[2]。甘蔗中存在多种具有生理活性的化合物，如黄酮类、多酚类、单宁以及多糖，使其具有较强的抵抗突变、抵抗氧化和抵抗炎症的能力，还能够降低心脑血管疾病的发生，从而加强人体的免疫系统[3-4]。因此利用甘蔗汁发酵可以生产富含营养物质的保健果酒。

红曲米，又名红曲，直接在大米上接种红曲霉发酵而成[5]。红曲次级代谢产物之一的天然红色色素——红曲色素（MP），有助于防患癌症、降血压血脂、控制肥壮及染色的功能，在食品和医药行业被大范围地使用[6]。红曲中的λ-氨基丁酸（GABA），它是一种能抑制突触的化学递质，具有加强记忆力、利于减肥等多种生物活性的功能性氨基酸[7]。红曲米多用于黄酒、米酒等饮品的酿造，红曲米应用于果酒酿造鲜有相关报道[8]。

试验将红曲米作为发酵菌种应用到甘蔗果酒的酿造，整合红曲米与甘蔗的营养和保健功能，酿造一款保健值更高的风味甘蔗果酒，为果酒增加新的产品，同时拓宽红曲米的应用范围，也为拓宽甘蔗产业发挥重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗汁（广西壮族自治区甘蔗研究所提供甘蔗，实验室压榨取甘蔗清汁）；红曲米（云南渗泉调味食品有限公司）。

1.1.1 试验药品

葡萄糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水杨酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；福林酚（分析纯，南京化学试剂有限公司）；DPPH标准样品（分析纯，美国Sigma公司）；焦性没食子酸（分析纯，浙江温州市瓯海化工试剂厂）。

1.1.2 试验仪器与设备

MC0-40酒精计（余姚仪表二厂有限责任公司）；PL303电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Sup-250生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；雷磁pHS-3E型pH酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；UVmini-1240紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；TW12恒温水浴锅[优莱博技术（北京）有限公司]；SW-CJ-IBJ单人单面净化工作台（苏州泽化设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗汁的制备

新鲜甘蔗→清洗→压榨→过滤→甘蔗清汁→发酵备用

1.2.2 酒精度的测定

使用酒精计法[9]。

1.2.3 残总糖的测定

使用DNS法（3, 5-二硝基水杨酸法）[10]。

葡萄糖标准曲线的绘制：称取足量的葡萄糖烘干至恒重后，精确称取50 mg，用少量蒸馏水溶解并定容到50 mL，即可得到1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。取9支试管，分别按照表1操作。

表1 葡萄糖标准曲线的制作单位：mL

将各管混合均匀，在沸水浴中加热5 min，待冷却到室温后，向各管中加蒸馏水到25 mL，摇匀后在波长为540 nm处测量吸光度，得到葡萄糖标准曲线数据，如表2所示。

表2 葡萄糖标准曲线数据

如图1所示，葡萄糖标准曲线回归方程y=0.579 8x-0.009 3，相关系数为R2=0.993 5，说明吸光度与葡萄糖含量之间的回归效果较好，可用于样品中葡萄糖含量的测定。

图1 葡萄糖标准曲线

1.2.4 样品残总糖含量的测定

发酵样品总糖转化还原总糖：取5 mL的发酵液于150 mL锥形瓶中，加入10 mL且浓度6 mol/L的HCl溶液，在60 ℃水浴中30 min，待冷却后，加入10 mL 6 mol/L的NaOH溶液中和，用蒸馏水定容到100 mL，即为总糖转化还原糖溶液。取1 mL转化糖溶液，按表2的方法进行残总糖含量的测定，经过相关计算后即可得到最终的残总糖含量。

1.2.5 甘蔗果酒发酵工艺优化的单因素试验

1.2.5.1 红曲米添加量的确定

甘蔗汁装液量为60%（V/V），分别添加1%，2%，3%，4%和5%的红曲米，在温度28 ℃、甘蔗汁初始pH 4.0条件下，发酵6 d后测定残总糖和酒精度，以确定较佳的红曲米添加量。

1.2.5.2 发酵起始pH的确定

甘蔗汁装液量为60%（V/V），加入3%的红曲米，甘蔗汁的初始pH调整为3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，在温度28 ℃条件下发酵6 d后测定残总糖和酒精度，以确定较佳的甘蔗汁初始pH。

1.2.5.3 发酵温度的确定

甘蔗汁装液量为60%（V/V），加入3%的红曲米，调整甘蔗汁初始pH为4.0，分别在24，26，28，30和32 ℃温度下，发酵6 d后测定残总糖和酒精度，以确定较佳的发酵温度。

1.2.5.4 发酵时间的确定

甘蔗汁装液量为60%（V/V），加入5%的红曲米，甘蔗汁起始pH为4.0，调整温度28 ℃，分别在发酵3，4，5，6和7 d后，测定残总糖和酒精度，以确定较佳的发酵时间。

1.2.6 甘蔗果酒发酵工艺优化的正交试验

基于单因素试验的结果，以红曲米添加量（A）、甘蔗汁初始pH（B）、发酵时间（C）为考察因素，采用正交试验进行发酵工艺的优化，各因素和水平如表3所示。

表3 正交试验因素和水平的设计

1.2.7 抗氧化性的测定

采用DPPH法[11-12]。

1.2.7.1 DPPH母液的配制

精准称取5 mg DPPH标准样品，用少量无水乙醇将其溶解并定容到100 mL，暗光反应30 min，即可得到0.05 g/L的DPPH母液。

1.2.7.2 DPPH自由基清除测定

摇匀后将表4中两种试剂（对照液及含样品液）在暗光的室温条件下静置30 min，测定其在517 nm处的吸光度。清除率按式（1）计算。

表4 DPPH自由基清除测定

1.2.8 总酚含量的测定

采用福林法[13]测定。

1.2.8.1 没食子酸标准曲线的建立

精准称取2 mg没食子酸标准品，用少量蒸馏水将其溶解并定容到100 mL，即为20 μg/mL没食子酸标准溶液。取8支试管，分别按照表5操作。

表5 没食子酸标准曲线的制作单位：mL

充分混匀并静置5 min后，加入1.5 mL碳酸钠溶液（20%），摇匀后加蒸馏水至10 mL，在水浴75 ℃下充分反应10 min，冷却后在760 nm波长下测其吸光度，得到没食子酸的标准曲线数据，如表6所示。

表6 没食子酸标准曲线的数据

如图2所示，没食子酸标曲的回归方程y=0.103x+0.035 4，相关系数R2=0.991 7，说明吸光度与没食子酸含量之间的回归效果较好，可用于样品总酚含量的测定。

图2 没食子酸标准曲线

1.2.8.2 样品中总酚含量的测定

各取1 mL甘蔗汁和甘蔗果酒，按照1.2.8.1的方法进行没食子酸标准曲线的建立，并经过计算后得到最终的总酚含量。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 红曲米添加量的确定

红曲米添加量直接影响到发酵菌种的生长速度及其发酵周期，从而影响发酵产酒量。由图3可知，酒精度随红曲米添加量的增加先增大后减少。当加入3%红曲米时，酒精度达到最高10.7%vol，残总糖含量为1.43 g/L。其原因有可能是：红曲米添加量过少时，微生物生物量低导致甘蔗糖分转化率低，不利于酒精的产生；红曲米添加量过量时，发酵液中营养物质大多数被用于红曲霉菌体的生长需要，导致酒精的生成量少[14]。因此较佳的红曲米添加量在3%左右。

图3 红曲米添加量对酒精度和残总糖的影响

2.1.2 初始pH的确定

pH会影响微生物的酶活力甚至影响物质通过细胞膜的难易程度，从而影响酒精的产量。由图4可知，甘蔗汁的初始pH为4.5时，酒精度达到最高14.5%vol，残糖量为1.046 g/L。初始pH＜4.5时，酒精度随初始pH的增加而逐渐升高。初始pH＞4.5时，酒精度随初始pH的增加而逐渐降低。分析其原因：pH太低或太高容易导致酶失活，继而影响微生物代谢从而导致酒度低[15]。因此较适宜的甘蔗汁初始pH在4.5左右。

图4 初始pH对酒精度和残总糖的影响

2.1.3 发酵时间的确定

发酵时间的长短对发酵菌种的生长和代谢能力有影响。由图5可知，随着发酵时间的增加，酒精度先增加后保持不变。发酵到达6 d，产酒精度最高15.3%vol，残糖量为1.65 g/L。分析其原因：发酵时间短，培养基中的营养物质利用不充分，转化生成的酒精量少；发酵时间过长，培养基中营养物质被消耗完，生成的酒精量保持不变[16]。因此较合适的发酵时间为6 d。

图5 发酵时间对酒精度和残总糖的影响

2.1.4 发酵温度的确定

发酵温度的高低直接影响到发酵菌种的酶活性以及其生长周期，同时影响发酵溶液中的O2浓度、黏度及渗透压，进而影响酒精的产量。由图6可知，随着发酵温度的增加，酒精度先增加后降低。在28 ℃发酵温度下，达到最高的酒精度15.6%vol，残糖量1.52 g/L。分析其原因：发酵温度太低，导致微生物生长代谢弱，转化率低而积累酒精少；温度过高，导致微生物代谢降低甚至丧失，导致酒精产量低。据报道，发酵温度高时，发酵菌种的生长周期变短，发酵过程中产酸速度加快，酸度增加，从而导致酒度降低[17]。适宜温度时，微生物菌株生长代谢旺盛，有利于糖分转化酒精，因此发酵温度28 ℃较为适宜。

图6 发酵温度对酒精度和残总糖的影响

2.2 发酵工艺优化正交试验的结果与分析

根据正交试验的设计方案，进行发酵，分别测定其酒精度，结果见表7。

表7 正交试验设计及其结果

结果表明，对酒体酒精度的影响顺序为红曲米添加量＞发酵时间＞甘蔗汁初始pH。最适宜的发酵工艺条件组合为A3B2C1，即红曲米添加量5%、甘蔗汁起始pH 4.5、发酵时间4 d。以最优组合A3B2C1条件做3次验证试验，酒精度为15.6%vol，残总糖为1.54 g/L。

对正交试验的结果进行方差分析，结果见表8。结果表明，在选定试验条件下，红曲米添加量、甘蔗汁初始pH及发酵时间对酒体酒精度的影响均不显著（P＞0.05）。但在均不显著的情况下，红曲米添加量对酒体酒精度的影响最大。

表8 正交试验结果的方差分析

2.3 总酚含量测定

试验结果得到甘蔗汁的总酚含量27.17 mg/mL，而甘蔗果酒总酚含量为29.44 mg/mL。甘蔗果酒的总酚含量略微大于甘蔗汁。其原因应该是红曲米中菌株生长代谢过程中会产生酚类物质，如没食子酸、芥子酸、芦丁等，而乙醇经常用作提取总酚的溶剂[18]。甘蔗汁经过发酵产生的乙醇对总酚有抽提作用。

图7 总酚含量的比较

2.4 抗氧化性测定

自由电子的存在对人体有害，因为它会从细胞中抢夺电子与之配对，从而导致细胞衰老、死亡，而多酚类物质，如黄酮、单宁、没食子酸及多糖等，其功能基团可以与这些自由电子进行配对，因而削弱自由基对人体的影响。DPPH含有很多的未配对自由电子，常被用于抗氧化性的测定。由图8可知，甘蔗汁的抗氧化性为50%，甘蔗果酒的抗氧化性为62.8%。