四君子汤对高乳糖饲喂脾虚证大鼠的治疗作用研究❋

卢梦雄， 黄金科， 王一帆， 薛 红， 王凤云， 唐旭东,△

(1.北京大学中医药临床医学院(西苑)， 北京 100091；2.中国中医科学院西苑医院， 北京 100091)

脾是中医藏象理论的重要组成部分，生理功能主要体现在脾主运化谷食和水饮，脾主统血，在体合肉主四肢[1]。脾虚证多由饮食失节、损伤脾胃，或过于劳神、损伤脾气，或素禀不足、年老体衰，或过服苦寒泻下药物、损伤脾阳所致。脾虚证者出现气短乏力、语声低微、面色萎黄、食少便溏、四肢无力等症状。四君子汤由人参、白术、茯苓、炙甘草4味药物组成，出自《太平惠民和剂局方》，具有补气健脾之功效，是治疗脾胃气虚证的经典名方，临床应用较多[2]。栀子性苦寒伤胃，脾虚便溏者不宜用，用之则加重病情。

东亚人群由于成年后乳糖酶活性缺乏，乳糖不能被消化、吸收，易出现腹痛、腹胀、腹泻、肠鸣等乳糖不耐受症状[3-5]。随着乳制品消耗增加，乳糖不耐受在我国发病逐渐上升[5-7]。此症状与脾虚证有类似之处，故可用于脾虚证模型研究[8]。本研究用高乳糖饲料饲喂模拟饮食偏嗜和泻下之法，用水平台站立法模拟劳倦过度，并增加不定时投喂模拟饥饱失常。使用定制AIN-93 G纯化饲料作为基本饲料[9]，以满足大鼠生长发育所需营养，并在各大营养素总量不变的基础上设计高乳糖饲料，避免普通饲料中不可控因素对实验结果的影响。根据课题组前期研究结果选择3周的造模时间，并用梯度高乳糖饲料[10]，使模型达到最佳效果。

目前对脾虚证模型的评价，除类比人的脾虚表现外，多根据脾的功能和特性类比相应指标，如血清D-木糖吸收率、甘油三酯(triglycerides,TG)和胃蛋白酶原作为脾主运化功能辅助实验室参考指标[10-12]，血小板数量作为脾主统血功能的参考指标[13]，抓力、骨骼肌三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量、肌糖原含量作为脾在体合肉、主四肢的参考指标[14-16]，胃饥饿素含量作为脾在志为思的参考指标[17]。但目前研究评价指标多较单一且不全面，故本研究将对上述指标进行检测以全面评价四君子汤对高乳糖饲喂脾虚证大鼠模型的疗效和作用，并用加重脾虚的栀子干预，以期达到方与证的互相验证。本研究通过中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会批准(批号2019XLC004)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(260±20)g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK (京) 2019-0010。常规饲料适应性喂养1周，每日日光灯照射(8∶00-20∶00)，室内温度(22±2)℃。

1.2 药物

实验所用药物均购自中国中医科学院西苑医院药房，四君子汤按《太平惠民和剂局方》原方比例，即人参、白术、茯苓、炙甘草的质量比为3∶3∶3∶2，用水煎成汤剂，分别浓缩成生药含量0.5 g/mL(低剂量)、1 g/mL(中剂量)、2 g/mL(高剂量)的药剂。同样栀子用水煎成汤剂，浓缩成生药含量1 g/mL。

1.3 主要试剂及仪器

40%、45%、50%高乳糖饲料和标准AIN-93 G标准饲料(北京科澳协力饲料有限公司);D-木糖(北京Coolaber公司，货号 CX12001-100 G)；D-木糖试剂盒(英国Cohesionbio公司，货号 CAK1238)；大鼠胃蛋白酶原酶联免疫试剂盒、大鼠饥饿素酶联免疫试剂盒、TG生化试剂盒、ATP生化试剂盒、肌糖原生化试剂盒(湖北艾恩斯生物科技有限公司，货号34607、30838、30371 S、30726 S、34667 S)(见表1)。

表1 饲料配方(单位：g)

自制水环境小平台站立箱(112 cm×62 cm×41 cm)，设置15个小平台，平台直径8 cm、高10 cm，平台周边注水，水深 2 cm，水温保持(20±2)℃。Z326K型高速冷冻离心机，德国Siemens公司；Synergy LX型酶标仪，美国Biotek公司；YLS-13A型大小鼠抓力测定仪，上海移数信息科技有限公司。

1.4 分组、模型制备与药物干预

随机将60只SD大鼠分为正常组、模型组、四君子汤低剂量组、四君子汤中剂量组、四君子汤高剂量组、栀子组6组各10只。正常组给予标准配方饮食，每日灌胃0.9%氯化钠溶液2 mL作为对照。其余组按每周增高5%浓度乳糖给予40%、45%、50%高乳糖饲料，每日水平台站立15 h，不定时喂食，并每日灌胃对应中药2 mL，造模与给药共3周。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 体质量测定 每天观察动物毛发神态活力，取材前称量动物体质量。

1.5.2 粪便含水量测定 取材前收集各组大鼠湿便称重，放入37 ℃烘箱中烘烤24 h干便称重，含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5.3 抓力测定 每只大鼠取材前均进行抓力测定，每次连续测3次取平均值。

1.5.4 血清D-木糖含量测定 取材时按1 mL/100 g剂量给大鼠灌胃3% D-木糖溶液，2 h后麻醉，腹主动脉取血，离心取血清，分光光度法测量全部大鼠血清D-木糖含量。

1.5.5 血清胃蛋白酶原、胃饥饿素、甘油三酯测定 腹主动脉取血离心后取血清，每组各取5只大鼠进行检测。胃蛋白酶原与胃饥饿素用Elisa法、TG用分光光度法进行测定。

1.5.6 肌肉三磷酸腺苷、糖原测定 每组取5只左后腿腓肠肌，液氮冷冻备用，分光光度法测定ATP、糖原含量。

1.5.7 小肠病理学 截取所有大鼠幽门下15 cm肠段，用0.9%氯化钠溶液清洗干净，放入多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，苏木素-伊红染色观察小肠绒毛和腺体的病理形态。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般体征

正常组大鼠皮毛光亮，肛门干净，精神良好，活动度正常，粪便颗粒分明，体质量正常增长。模型组大鼠给予高乳糖饲料1～2 d后出现明显黄色水样稀便，且随着造模时间的延长，皮毛逐渐变黄凌乱、失去光泽，肛周出现污秽，倦卧眯眼，活动度差，体质量增长缓慢甚至负增长。四君子汤低、中、高剂量组大鼠最开始表现与模型组相同，用药后水样便症状逐渐缓解，个别大鼠排出成型便，皮毛逐渐光亮顺滑整洁，精神状态及活动度转好。栀子组大鼠则一直维持脾虚状态到实验结束。

2.2 各组大鼠体质量比较

图1示，与正常组比较，模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，四君子汤各剂量组大鼠体质量虽有升高但差异无统计学意义，栀子组大鼠体质量明显低于模型组(P<0.01)。

注: 与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：△ △P<0.01；与栀子组比较：##P<0.01；低、中、高剂量组均给予四君子汤图1 各组大鼠体质量比较

2.3 各组大鼠抓力比较

图2示，与正常组比较，模型组大鼠抓力明显降低(P<0.01)；与模型组比较，四君子汤低、中、高剂量组大鼠抓力明显升高(P<0.05，P<0.01)。

注: 与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：△ P<0.05，△ △P<0.01；低、中、高剂量组均给予四君子汤图2 各组大鼠抓力比较

2.4 各组大鼠粪便含水量比较

图3示，与正常组比较，模型组大鼠粪便含水量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，栀子组大鼠粪便含水量明显升高(P<0.05)，其余组比较差异无统计学意义。

注: 与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：△ P<0.05；低、中、高剂量组均给予四君子汤图3 各组大鼠粪便含水量比较

2.5 各组大鼠血清D-木糖含量比较

图4示，与正常组比较，模型组大鼠血清D-木糖含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，高剂量组大鼠血清D-木糖含量明显升高(P<0.05)。

注: 与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；低、中、高剂量组均给予四君子汤图4 各组大鼠血清D-木糖含量比较

2.6 各组大鼠血清胃蛋白酶原含量比较

图5示，各组大鼠血清胃蛋白酶原含量比较差异无统计学意义。

注：低、中、高剂量组均给予四君子汤图5 各组大鼠血清胃蛋白酶原含量比较

2.7 各组大鼠血清胃饥饿素含量比较

图6示，与正常组比较，模型组大鼠血清胃饥饿素含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，各用药组大鼠血清胃饥饿素含量有所升高，但差异无统计学意义。

注: 与正常组比较*P<0.05；低、中、高剂量组均给予四君子汤图6 各组大鼠血清胃饥饿素含量比较

2.8 各组血清甘油三酯含量比较

图7示，与正常组比较，模型组大鼠血清TG含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，高剂量组大鼠血清TG含量明显降低(P<0.05)。

注: 与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：△ P<0.05；低、中、高剂量组均给予四君子汤图7 各组大鼠血清甘油三酯含量比较

2.9 各组肌肉大鼠三磷酸腺苷含量比较

图8示，与正常组比较，模型组大鼠肌肉ATP含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，高剂量组大鼠肌肉ATP含量明显升高(P<0.01)。

注: 与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01；低、中、高剂量组均给予四君子汤图8 各组大鼠肌肉三磷酸腺苷含量比较

2.10 各组大鼠肌肉糖原含量比较

图9示，与正常组比较，模型组大鼠肌肉糖原含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，四君子汤低、中、高剂量组和栀子组大鼠肌肉糖原含量均明显升高(P<0.05，P<0.01)。

注: 与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；低、中、高剂量组均给予四君子汤图9 各组大鼠肌肉糖原含量比较

2.11 各组大鼠血小板含量比较

图10示，各组大鼠血小板含量比较差异无统计学意义。

注：低、中、高剂量组均给予四君子汤图10 各组大鼠血小板含量比较

2.12 各组大鼠小肠病理形态比较

图11示，与正常组比较，模型组大鼠小肠绒毛和腺体结构完全破坏。与模型组比较，四君子汤低、中、高剂量组大鼠小肠绒毛结构完整，绒毛和腺体逐渐增密，以高剂量组效果最明显。

图11 各组大鼠小肠病理形态比较(HE染色×100)

3 讨论

依据中华中医药学会脾胃病分会发布的《脾虚证中医诊疗专家共识意见(2017)》中脾虚证诊断标准[18]，高乳糖饲喂复合因素法脾虚证大鼠模型一般体征判定可为溏稀便或水样便，体质量增加缓慢或减轻，纳呆、少动、皮毛干枯少光、抓力下降等。模型组大鼠脾虚体征明显，栀子组更甚，各剂量四君子汤组大鼠精神和活动度等逐渐好转，说明脾虚模型造模成功，且四君子汤起到了对证治疗作用。

在脾主运化功能方面，血清D-木糖含量是判别脾虚证的经典指标，血清TG可作为脾运化脂质能力的指标，粪便含水量可作为脾运化水液能力的指标，小肠的病理性改变反映脾吸收水谷精微的功能失调。四君子汤对上述指标的改善作用说明四君子汤能够对证治疗这一脾虚证模型，使脾主运化的功能恢复。四君子汤干预后，大鼠运化脂质能力趋于正常，脂质在体内累积减少，水液运化功能部分恢复，小肠绒毛和腺体恢复完整。栀子对本模型则无明显治疗作用，有的指标甚至加重。各组血清胃蛋白酶原含量比较差异无统计学意义，可能与相关文献中造模方法不同有关。

脾在体合肉、主四肢方面的指标可以抓力、肌肉ATP和糖原含量为代表。四君子汤使大鼠抓力恢复到正常水平，高剂量组大鼠肌肉ATP含量升高明显，栀子则无改善作用。各四君子汤组和栀子组大鼠的肌肉糖原含量均明显升高，栀子组大鼠的含量升高可能与其药理成分有关。上述抓力、肌肉ATP和糖原含量的上升说明四君子汤对脾主肌肉的功能有恢复作用。

脾主统血方面，各组大鼠血小板含量比较差异无统计学意义，可能是由于取材时间错过了本模型脾主统血功能降低最明显的时间点。脾在志为思可体现于血清胃饥饿素的水平，胃饥饿素是“脑肠轴”调控激素，模型组大鼠胃饥饿素含量明显降低，各用药组大鼠有所升高,但差异无统计学意义，内在机制有待深入研究。

综上所述，本研究证明四君子汤能够显著改善高乳糖饲喂叠加水平台法及饥饱失常因素所致脾虚证模型的一般体征、生化指标、病理表现，方与证互相印证，栀子不能改善则反证上述结论。