基于JAK/STAT3信号通路探讨右归丸对骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响❋

包程公， 杨永菊， 马贤德， 郑 曲， 张 宇， 关雪峰△

(1.辽宁中医药大学， 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院， 沈阳 110032)

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)属于慢性退行性关节病，主要病理特征为关节软骨退变以及关节周围骨质增生[1]。OA多见于中老年人群，女性较男性更多，资料显示该病在我国>40岁人群中的发病率达10%～17%，并且随着肥胖人口增加和人口老龄化发展，其发病率逐年升高[2]。关节疼痛、肿胀、活动不利等为OA主要表现，晚期可致残。临床多采用非甾体类抗炎药、保护软骨药物等对症治疗，但副作用明显且无法控制其进展[3]，目前亟需寻找更为安全有效的药物。中医认为OA属于“痹证”“骨痹”范畴[4]，多由年老肾阳不足、又感受风、寒、湿外邪、气血瘀滞所致，治疗以温补肾阳、化瘀除痹为原则，针灸、中药复方、中成药等多种方法治疗该病取得了较好的效果[5-7]。右归丸是温补肾阳法的代表方，在OA的临床治疗中疗效肯定[8]，但其相关作用机制尚未完全明确。本次研究以Janus激酶(janus kinase，JAK)2/信号传导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3信号通路为切入点，探讨右归丸对OA大鼠软骨细胞凋亡的影响。本研究通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准(批号21000042021052)。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠48只，8周龄，体质量240～280 g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK(辽)2019-0001。将大鼠分笼饲养，环境温度、湿度分别保持在(21±1)℃和(50±5)%，昼夜交替时间为12 h，保证充足饮水与标准饲料，适应性饲养5 d后开始实验。

1.2 药物

右归丸药物组成：熟地黄24 g，鹿角胶、山药、杜仲、菟丝子各12 g，山茱萸、当归、枸杞子各9 g，附子、肉桂各6 g，购自辽宁省中医医院药剂科，煎煮并制成浓度为2 g/mL的右归丸药液，4 ℃冰箱保存。塞来昔布胶囊(辉瑞制药有限公司，国药准字J20140072，每粒0.2 g)采用0.9%氯化钠溶液制成0.4 mg/mL塞来昔布悬液，即用即配。

1.3 主要试剂与仪器

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号GOY-9884)、通用SP检测试剂盒(货号GOY-D12592)，上海谷研实业有限公司；HE染色试剂盒(货号H1200KT)、DAB显色试剂盒(货号YDJQ3587)、ECL试剂盒(货号YDJQ3429)，上海羽哚生物科技有限公司；PVDF膜(上海嵘崴达实业有限公司，货号3010040001)；BCA试剂盒(南京莱富赛生物科技有限公司，货号PA001)；兔抗大鼠JAK2，STAT3、B淋巴细胞瘤(B-lymphoma，Bcl)-2、Bcl-XL关联XL蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax-XL)抗体、β-肌动蛋白(β-actin)抗体、山羊抗兔二抗，货号分别为FNab04432、FNab08299、FNab00840、FNab00811、FNab00873、FNab09778，武汉菲恩生物科技有限公司。

DCM8型光学显微镜，德国Leica公司；ELITE300PLUS型垂直电泳仪、E-Blotter型湿转槽，美国WEALTEC公司。

2 方法

2.1 分组、造模及给药方法

随机将大鼠分为假手术组12只和造模组36只。全部大鼠仰卧固定，1.5 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠，麻醉之后打开右侧后肢膝关节的关节腔，造模组剪断内侧副韧带和前后交叉韧带，验证前抽屉试验呈阳性，同时将内侧半月板完整摘除；假手术组仅打开关节腔，不进行其他操作；青霉素冲洗创口后缝合。术后给予青霉素肌肉注射3 d抗感染。术后第2 天开始，定时驱赶动物以强迫其活动后肢30 min，每日1次[9]。6周后，假手术组取1只大鼠、造模组取2只大鼠，采用HE染色法观察患肢膝关节软骨组织，判定模型是否建立成功。

造模过程中有1只大鼠死亡。将造模成功的33只大鼠分为模型组、右归丸组及塞来昔布组各11只。模型组、假手术组分别给予0.9%氯化钠溶液，右归丸组给予2 g/mL右归丸溶液，塞来昔布组给予0.4 mg/mL 塞来昔布悬液，各组大鼠均灌胃给药，体积为10 mL/kg，连续8周。

2.2 标本采集与处理

末次干预后第2天麻醉处死大鼠，完整取出患侧膝关节的软骨组织，洗涤后切取1/2置于10%甲醛内固定，14 h后取出置于脱钙液内处理24 h，石蜡包埋，切片机制成5 μm切片，以备HE、免疫组化以及TUNEL染色观察；另外1/2软骨组织冻存于-80 ℃冰箱，以备Western blot检测。

2.3 HE染色法观察大鼠软骨形态

将软骨组织石蜡切片取出，常规采用二甲苯处理脱蜡，100%～95%～85%乙醇依次处理水化，之后HE试剂盒染色、脱水、透明、封片。在光学显微镜下观察染色结果并拍照，参照文献采用Mankin评分评估各组软骨损伤情况[10]。

2.4 TUNEL染色法观测大鼠软骨组织细胞凋亡情况

取软骨组织石蜡切片并脱蜡、水化，3%H2O2处理3 min。按照TUNEL试剂盒说明书进行染色、脱水、透明、封片[11]，采用光学显微镜观察并采集图像。凋亡阳性细胞呈棕黄色，对切片中随机5个视野的凋亡细胞、总细胞进行计数并取平均值。细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

2.5 免疫组化法检测大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL表达

取软骨组织石蜡切片，抗原修复，3% H2O2去除内源性过氧化氢酶，5%牛血清白蛋白溶液封闭，分别用JAK2(1∶200)、STAT3(1∶100)、Bcl-2(1∶200)、Bcl-XL(1∶100)一抗工作液处理2 h，山羊抗兔二抗工作液(1∶100)处理1 h，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片[11]。采用光学显微镜观察，阳性细胞被染成棕黄色，计数JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL阳性细胞数和总细胞数，分别计算阳性表达率并取平均值。

2.6 Western blot法测定大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达

将冻存的软骨组织剪碎加入细胞裂解液，BCA法确定总蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转至PVDF膜上；封闭后分别用JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜；山羊抗兔二抗(1∶3000)室温孵育1 h，ECL试剂盒显色[12]。

采用ImageLab软件分析各条带灰度值，计算JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL灰度值与β-actin的比值。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠软骨组织病理学观察

图1示，HE染色显示，假手术组大鼠关节面及滑膜结构完整，软骨细胞呈水平排列，关节软骨边缘光滑；模型组大鼠关节软骨边缘严重破坏，软骨层细胞变薄、排列紊乱，软骨下骨增生，可见脱水固缩坏死的软骨细胞，各层软骨结构无法分辨；右归丸组和塞来昔布组大鼠软骨结构趋于正常，软骨细胞排列偶欠规整，关节软骨表面欠光滑。

注：A.假手术组；B.模型组；C.右归丸组；D.塞来昔布组图1 各组大鼠软骨组织病理学结果比较(HE染色 ×200)

表1示，与假手术组比较，模型组大鼠软骨Mankin评分升高(P<0.05)；与模型组比较，右归丸组及塞来昔布组大鼠软骨Mankin评分降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠软骨Mankin评分比较

3.2 各组大鼠软骨组织AI比较

表2图2示，TUNEL染色结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠软骨AI明显升高(P<0.05)；与模型组比较，右归丸组及塞来昔布组大鼠软骨AI明显降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠软骨组织AI比较

图2 各组大鼠软骨组织细胞凋亡结果(TUNEL染色 ×200)

3.3 各组大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL阳性表达率比较

表3图3示，免疫组化染色结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠软骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL阳性表达率明显降低(P<0.05)。与模型组比较，右归丸组及塞来昔布组大鼠软骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL阳性表达率明显升高(P<0.05)。

表3 各组大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL阳性表达率比较

注：Janus激酶(Janus kinase，JAK)2，信号传导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3，B淋巴细胞瘤(B-lymphoma，Bcl)-2，Bcl-2关联XL蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax-XL)图3 各组大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL免疫组化染色结果(×400)

3.4 各组大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达水平比较

表4图4示，与假手术组比较，模型组大鼠软骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较，右归丸组及塞来昔布组大鼠软骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。

表4 各组大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达水平比较

注：1.假手术组；2.模型组；3.右归丸组；4.塞来昔布组；Janus激酶(Janus kinase，JAK)2，信号传导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3，B淋巴细胞瘤(b-lymphoma，Bcl)-2，Bcl-2关联XL蛋白(bcl-2 associated X protein，Bax-XL)图4 各组大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL 免疫印迹结果

4 讨论

OA的发生与年龄、创伤、肥胖、过度负重等有关，其发病机制尚未完全阐明。目前认为主要涉及基质金属蛋白酶降解、细胞因子、细胞凋亡、水通道蛋白等多个方面[13-15]，其中软骨细胞凋亡可直接导致关节软骨退变、钙化，对关节功能造成不良影响，是近年来的研究热点。通过抑制软骨细胞凋亡进而阻断关节退变对于OA的防治具有重要意义，也是新药研究的主要方向之一。

OA属于中医“痹证”“骨痹”“痿证”范畴，常见病机为肾阳不足、气血瘀滞。本研究针对此病机采用温补肾阳之右归丸治疗。右归丸方中附子温阳散寒止痛，肉桂温阳通脉、散寒止痛，鹿角胶有填精养血、温补肝肾之效[16]，三者相配能补肾中元阳并温中驱寒，是为君药；熟地黄填精益髓、滋阴养血；枸杞滋肝补肾；山药既补肾固精养阴又益脾肺之气；山茱萸补肝益肾，四者养阴补肾健脾，取“阴中求阳”之意，是为臣药；再加杜仲补肝肾强筋骨，当归补血活血止痛，菟丝子补益肝肾3味佐药，全方共奏温肾补阳、益精填血之效。现代药理研究发现，鹿角胶中的多肽、氨基酸等有效成分可抑制软骨细胞凋亡，促进受损软骨修复，还能抗炎镇痛[17]；当归有改善微循环的药理作用，亦能减少软骨细胞凋亡，促进骨关节炎缓解[18]。由此可见，用右归丸治疗OA具有一定的理论基础。本研究成功建立了OA大鼠模型，模型组大鼠软骨组织出现与人类OA类似的病理变化，Mankin评分升高，软骨细胞AI也显著增加，证实OA存在软骨损伤及细胞凋亡增多的情况；而经右归丸治疗后，大鼠Mankin评分、软骨细胞AI均低于模型组，且与塞来昔布组比较差异无统计学意义，表明右归丸能够有效减轻OA引起的软骨组织损伤程度，抑制软骨细胞凋亡，发挥较好的治疗效果。

本研究从JAK/STAT3信号通路入手，分析右归丸发挥作用的具体机制。JAK/STAT3信号通路广泛参与机体炎症及细胞分化、凋亡及炎症反应过程，与OA的发病关系密切。JAK及相关受体、STAT为该通路关键成分，可将细胞外化学信号处理后传递给细胞核，调节细胞增殖、损伤、凋亡等重要基因的转录和表达，产生相应生物学效应。刘军等[19]对OA小鼠模型软骨细胞JAK2/STAT3信号通路相关蛋白分组检测发现，抑制软骨细胞凋亡对软骨细胞线粒体的抗氧化应激能力有增强作用，而该通路参与软骨细胞凋亡的调节过程。胡炯等[20]检测OA模型大鼠及健康大鼠关节软骨中磷酸化-JAK2、磷酸化-STAT3、Bcl-2、Bax 蛋白表达水平发现，与健康大鼠比较，OA大鼠的JAK2/STAT3信号通路被显著抑制，软骨细胞凋亡速度提高。本研究结果显示，与模型组比较，右归丸组及塞来昔布组大鼠软骨组织JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL表达均高于模型组，Bcl-2和Bcl-XL均属于抗凋亡蛋白，对各种原因诱发的细胞凋亡均有抑制作用。该结果证实，右归丸能够激活JAK2/STAT3信号通路，上调软骨组织Bcl-2、Bcl-XL表达，对细胞凋亡发挥抑制作用。这可能是右归丸治疗OA的机制之一。

综上所述，右归丸能够有效减轻OA大鼠软骨组织损伤，减少软骨细胞凋亡，其作用可能与激活JAK/STAT3信号通路、上调抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表达有关。