黄芩苷对多重耐药铜绿假单胞菌慢性肺部感染大鼠的影响

李磊 王静 崔兰凤 吕思缘 郭雨菲 秦欣欣 王成祥

1.北京中医药大学第三附属医院呼吸科，北京 100029；2.北京中医药大学教务处，北京 100029；3.清华大学附属北京清华长庚医院中医科，北京 102218

近年来，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）的多重耐药性显著增加使得抗生素选择受限，导致多重耐药PA（multidrug resistantPseudomonas aeruginosa，MDRPA）慢性肺部感染患者死亡率升高[1-2]。而PA 可过度激活Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，导致促炎性细胞因子与抗炎细胞因子失衡，激发炎症“瀑布样效应”，导致肺组织损伤[3]，这也是导致慢性肺部感染患者死亡率高的重要病理机制。黄芩苷是从黄芩中分离出来的黄芩主要活性成分，被应用于多种炎症疾病的治疗[4-5]。基于此，本研究探讨黄芩苷对MDRPA慢性肺部感染大鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 实验用菌

实验菌株由北京中医药大学东直门医院检验科微生物室提供，菌株编号1607106。

1.2 实验动物

选取SPF 级SD 大鼠32 只，雄性，6～8 周龄，体重180～220 g，实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物质量合格证号：1100112011099 12348；实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，动物实验在中国中医科学院中药研究所生物安全实验室进行，经过实验动物伦理委员会审批（2020D30）。

1.3 实验药物

黄芩苷（批号110715-200514）购自中国食品药品监督管理局，纯度≥98%；哌拉西林他唑巴坦钠（Wyeth Lederle S.R.L，批号：AKGD/11）由北京中医药大学东直门医院药剂科提供。

1.4 主要试剂与仪器

大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）试剂盒（厦门仑昌硕生物科技有限公司，货号：31063）、大鼠白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA 试剂盒（厦门仑昌硕生物科技有限公司，货号：30194）、TLR4 抗体（Proteintech，货号：19811-1-AP）、NF-κB（p65 亚基）（NF-κB p65 subanit，NF-κB p65）抗体（Proteintech，货号：66535-1-Ig）。全自动多功能酶标仪（Multiskan MK3，Thermo）、电泳仪（JY300C，北京君意东方电泳设备有限公司）、实时定量聚合酶链式反应仪（polymerase chain reaction，PCR）（CFX-96，Bio-RAD 公司）。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组 将大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、西药组和黄芩苷组，每组8 只。

1.5.2 模型建立 将MDRPA 菌液浓度设为1.5×108CFU/ml；采用1 ml 胰岛素注射器滴入法制备MDRPA藻酸盐包被体。使用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，采用经口气管插管法将MDRPA藻酸盐包被体混悬液（0.1 ml/200 g）快速注入大鼠气管中。造模成功标准：大鼠肺组织匀浆培养出PA；感染慢性期可见肺组织实变、纤维增生、淋巴细胞浸润[6]。

1.5.3 干预措施 按直接折算法计算大鼠与人的临床等效剂量[7]。黄芩苷组给予0.8 g/（kg·d）黄芩苷灌胃（该浓度经预实验确定）；西药组给予0.8 g/（kg·d）哌拉西林他唑巴坦钠肌肉注射；空白组、模型组均给予与黄芩苷组等量的生理盐水灌胃。四组均连续给药14 d。

1.5.4 取材 给药结束后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心（3500 r/min，10 min，离心半径10 cm），取血清，-80℃冻存备用。取右肺组织于-80℃冻存，左肺组织置于4%的多聚甲醛中固定。

1.5.5 苏木精-伊红染色 将肺组织依次进行脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，染色。

1.5.6 ELISA 检测四组血清细胞因子TNF-α、IL-10每组随机取5 只大鼠的血清样本进行TNF-α、IL-10检测，具体实验操作步骤按照ELISA 试剂盒说明书进行。

1.5.7 qPCR 检测四组肺组织TLR4、NF-κB p65 mRNA表达 每组随机取3 只大鼠的肺组织，使用TRIzol 法提取肺组织总RNA；按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录；进行RT-PCR 反应，应用BIO-RAD CFX96 荧光定量PCR 仪记录数据，反应体系：PCR 上游引物2.0 μl、PCR 下游引物2.0 μl、cDNA2.0 μl、50×Rox参比染料0.4 μl、ddH2O 3.6 μl。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，59℃退火/延伸60 s，共45个循环。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组肺组织病理

空白组肺组织形态结构正常。模型组可见大量炎症细胞浸润，肺泡壁显著增厚。黄芩苷组浸润的炎症细胞较少，肺泡壁较薄。见图1。

图1 四组肺组织病理（苏木精-伊红染色，200×）

2.2 四组血清TNF-α 和IL-10 比较

模型组血清TNF-α 高于空白组，IL-10 低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。黄芩苷组血清TNF-α 低于模型组，IL-10 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 四组血清TNF-α 和IL-10 比较（pg/ml，）

表2 四组血清TNF-α 和IL-10 比较（pg/ml，）

注 与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-10：白细胞介素-10

2.3 四组肺组织TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平比较

模型组TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。黄芩苷组TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 四组肺组织TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平比较（）

表3 四组肺组织TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平比较（）

注 与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。TLR4：Toll 样受体4；NF-κB p65：核因子κB（p65 亚基）

3 讨论

在囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病等患者中，PA可引起慢性肺部感染[8-11]。TLR4 是一类在固有免疫中起关键作用的膜结合模式识别受体[12-14]。PA 的内毒素脂多糖被TLR4 识别并结合后，使磷酸化核因子抑制因子与NF-κB 分离，NF-κB p65 进入细胞核与DNA结合从而使促炎性细胞因子大量表达，激发炎症“瀑布样效应”，导致组织损伤[15-16]。TNF-α 是促炎性细胞因子，促进NF-κB 的活化，并诱导其他促炎性细胞因子释放[17]。IL-10 是抗炎细胞因子，具有抗炎作用[18-19]。近年来研究证实，抑制TLR4/NF-κB 通路能够减轻肺组织损伤[20-21]。

中药具有直接抑菌杀菌及调节机体平衡等作用[22-23]。有研究显示，中药对革兰氏阴性菌的直接抑菌、杀菌作用较弱[24-25]。本研究显示，黄芩苷可以减轻MDRPA慢性肺部感染大鼠肺组织炎性损伤，其抗炎机制可能与抑制TLR4/NF-κB 通路相关，值的临床进一步深入探索。