海星皂苷类化合物抗肿瘤分子对接研究

陈 宁，唐祉娟，刘 冰*，肖 迪，王贞妮

(1.哈尔滨商业大学 药物工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；2.教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076)

海星又名星鱼，属棘皮动物门(Echinodemata)、海星纲(Asteroidea)。海星含有大量的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、钙、铁、磷等常规物质，还含有海星皂苷、海星皂素等具有特殊功效的物质。因海星中不饱和脂肪酸的含量比陆地动物高很多，适合老年人适量食用，可增强记忆力、健脑益智；且海星大部分成分都是蛋白质，分解后与人体的氨基酸比例很接近，适合体质虚弱的人适量食用，可起到补虚健体的功效。海星味咸且性平，具有厚肠止泻、安神、和胃止痛等作用[1-3]，主要用于治疗甲状腺肿、胃痛胃酸、腹泻、癫痫等[4]。研究发现，海星中含有皂苷、甾醇、生物碱等多种活性成分，具有抗肿瘤、降糖等多种生物活性[5-9]，在海洋中药和保健食品的开发中具有重要的应用价值[10-11]。近年来，关于海星甾体化合物的提取及活性研究较多，尤其是对海星皂苷的研究[12]。赵君等[13]从海星壳的水提液中分离纯化出水溶性海星皂苷，体外抗肿瘤活性检测发现，所得皂苷纯品对胃癌细胞SGC-7901、宫颈癌细胞HeLa、肺癌细胞A-549和肝癌细胞Bel-7402均具有显著的抑制活性。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类结构相关的含锌内肽酶，介导结缔组织大分子的降解。哺乳动物的MMPs家族至少由20种酶组成，根据底物特异性和结构域的结构分为4个亚类[14]。其中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)构成MMPs家族中的明胶酶。在恶性肿瘤细胞运动的情况下，MMP-2和MMP-9具有降解基底膜和其它基质成分的能力。通过基因调控或药物作用降低MMP-9活性的干预可影响肿瘤细胞，因此，降低MMP-9活性可能是抗肿瘤的关键机制。由于MMPs在重建结缔组织模型中的核心作用，研究人员对其作为广泛退行性和炎症性疾病(如关节炎和动脉粥样硬化)治疗干预的靶点产生了极大兴趣。根据MMP-9的结构能够为这一重要的抗肿瘤靶点设计有效和特异的抑制剂[15]。

作者通过检索数据库收集海星皂苷类化合物，建立小分子配体库，基于MMP-9的晶体结构，利用分子对接技术筛选出与MMP-9有较强结合作用的海星皂苷类化合物，并通过Western blot检测海星皂苷类化合物对人乳腺癌细胞MCF-7的MMP-9蛋白表达的影响。

1 实验

1.1 技术平台

蛋白质晶体结构数据库(RSCB PDB http://www.rcsb.org)，小分子化合物结构数据库(SciFinder)，Pymol软件，AutoDock Vina分子对接程序。所有计算均在DELLT5820上执行。

1.2 小分子配体库的建立

海星皂苷类化合物从SciFinder数据库[16-33]中获得，利用Chem3D软件将其转换为mol2格式。对全部小分子配体，用分子程序MM2的最小能量模块进行优化，得到的稳定优势构象以mol2格式保存。利用Penbabel软件对mol2格式的小分子配体进行批量加工，并转换成pdbqt格式保存。

1.3 对接参数的确定

使用分子模拟软件Sybyl进行分子对接研究，探讨海星皂苷类化合物与MMP-9的作用模式。从PDB数据库中下载得到MMP-9的晶体结构。使用Notepad去除反异羟肟酸酯抑制剂和HOH等小分子，加入氢气，计算点电荷并设置原子类型，根据受体蛋白复合物中的配体和活性口袋确定对接活性部位和对接参数，保存加工后的蛋白。

1.4 分子对接

使用AutoGrid计算能量格点，根据原配体的坐标文件设置Grid Box中心坐标为：MMP-9(1GKC)：60.455、25.057、113.976，共有50×50×50个网格点，每个网格点的距离为0.037 5 nm。使用AutoDock搜索网格范围内受体，采用拉马克遗传算法进行构象搜索，能量评定最大次数为2 500 000，每个小分子配体都设定得到9个构象，计算CPU选择为10，其它参数选择默认值。运行AutoGrid进行网格点中相关能量的计算[34-36]。

使用AutoDock Vina[34-35]对MMP-9活性中心进行配体库的构象搜索，采用AutoDock 4.2搜索算法进行半柔性对接[37]。

1.5 数据与作用模式分析

采用Pymol软件进行分子对接打分及作用模式分析。

1.6 Western blot检测

取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7(5×106个)，用PBS缓冲液洗涤1次，分别加入剂量为7 μmol·L-1、14 μmol·L-1、21 μmol·L-1的化合物28/40/44，培养48 h；细胞裂解物立即于95 ℃下变性10 min；将细胞裂解液(25 μL)装载到7.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并在0.192 mol·L-1甘氨酸、0.025 mol·L-1Tris和20%甲醇中转印到PVDF膜上，冰上转膜1.5 h，用pH值7.5的5%脱脂牛奶封闭2 h，用TBS缓冲液/0.05%吐温20溶液洗涤3次，每次15 min；用TBST缓冲液按1∶200比例稀释；再用TBS缓冲液/0.05%吐温20溶液洗涤3次，每次15 min，斑点消失，在室温下用1∶10000稀释的过氧化物酶结合二级抗体；用TBS缓冲液/吐温20溶液洗涤3次后，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参比进行显色及统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 小分子配体库的构建

从SciFinder数据库获得60个海星皂苷类化合物，构建小分子配体库，其中与MMP-9对接效果较好的30个化合物的结构式如图1所示。

图1 与MMP-9对接效果较好的30个海星皂苷类化合物Fig.1 Thirty starfish saponins with good docking effect to MMP-9

2.2 对接方法的准确性验证

采用反异羟肟酸酯抑制剂与MMP-9进行对接，验证AutoDock 4.2参数设置的准确性。将MMP-9(1GKC)结构活性中心所结合的反异羟肟酸酯抑制剂取出作为配体，与删去了此配体的MMP-9(1GKC)重新对接(图2)。结果显示，对接结合自由能最低为-8.9 kcal·mol-1，其均方根偏差RMSD值为1.99(一般认为RMSD值<2，配体与受体可有效对接[33-34])，可见反异羟肟酸酯抑制剂已成功嵌入MMP-9表面的活性中心，表明本实验的参数设置合适，能较合理地模拟抑制剂与酶在活性中心的结合构象，对接方法可信[38]。

图2 反异羟肟酸酯抑制剂与MMP-9的对接模式

2.3 分子对接打分

将60个海星皂苷类化合物与MMP-9对接，其中对接效果较好(对接打分<-7)的30个化合物的打分结果列于表1。

表1 海星皂苷类化合物与MMP-9的对接打分

2.4 分子对接作用模式分析

采用AutoDock和Pymol软件分析60个海星皂苷类化合物与MMP-9的对接模式。发现在MMP-9活性中心的氨基酸残基中，Gly186、Leu188、His401、His405、His411、Pro421有可能与海星皂苷苷元结构中的羰基、羟基及糖上的羟基形成氢键，从而在对接时发挥重要作用，尤其是His401、His411、Pro421侧链上的O原子和N原子很容易与海星皂苷小分子配体相互作用形成氢键。另外，非结合相互作用(如范德华力和静电相互作用)在MMP-9活性中心与海星皂苷小分子配体之间形成稳定的结合构象方面也起着非常重要的作用。海星皂苷类化合物3、14、28、40、42、44与MMP-9具有较强的结合作用，它们进入MMP-9活性中心的关键口袋，并与关键氨基酸残基相互作用(图3)。

图3 海星皂苷类化合物3、14、28、40、42、44与MMP-9的对接模式Fig.3 Docking mode of starfish saponins 3,14,28,40,42,and 44 with MMP-9

2.5 海星皂苷类化合物28、40、44对人乳腺癌细胞MCF-7的MMP-9蛋白表达的影响(图4)

从图4可以看出，人乳腺癌细胞MCF-7在给药(海星皂苷类化合物28、40、44，用量10 μg·mL-1)48 h后，MMP-9蛋白表达量明显减少。

图4 海星皂苷类化合物28、40、44对人乳腺癌细胞MCF-7的MMP-9蛋白表达的影响Fig.4 Effect of starfish saponins 28,40,and 44 on expression of MMP-9 protein in human breast cancer cells MCF-7

3 结论

通过检索数据库收集海星皂苷类化合物，建立小分子配体库，基于MMP-9的晶体结构，利用分子对接技术筛选出与MMP-9有较强结合作用的海星皂苷类化合物3、14、28、40、42、44，它们是海星发挥抗肿瘤作用的关键化合物；通过Western blot检测，发现海星皂苷类化合物28、40、44可使人乳腺癌细胞MCF-7的MMP-9蛋白表达量减少。为海星抗肿瘤作用机制研究奠定了基础。