不同产地山羊角多类型资源性化学成分分析及差异研究

朱昭颖,郭盛,武文星,赵晶晶,刘睿,尚尔鑫,段金廒

(南京中医药大学/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用研究重点研究室,江苏 南京 210023)

山羊角为牛科动物山羊CaprahirusLinnaeus的角,作为药用始载于《神农本草经》,目前主要作为地方习用药材用于治疗小儿惊厥、高热神昏等疾病[1]。也有研究提示,山羊角可作为珍稀濒危药材羚羊角的类效资源,具有安全无毒、资源丰富的优势[2]。山羊角现已纳入多个省市的地方药材标准,但仅收载性状鉴别和显微鉴别等常规鉴别方法[3-4],尚少见相关活性组分的分析评价。

现代研究表明,山羊角含有蛋白质类、肽类、氨基酸类、核苷类[5]、巯基类[6]、无机元素类等化学成分,具有抗惊厥[7]、解热[8]、镇静、降血压[9]、抗病毒等药理作用。我国山羊品种丰富,其中60个品种的山羊可产角[10],且适生能力强,分布范围遍及全国。2021年我国山羊存栏量达13 345.2万只,其中：华北地区内蒙古存栏数为1 629.3万只,为山羊及其附加产品的主要产区；华东地区山东、江苏山羊存栏数均大于500万只；西南地区四川、云南山羊存栏数大于1 000万只[11]。

据此,本研究以不同产地山羊角为研究对象,对其水溶性蛋白、氨基酸类、核苷类、含巯基化合物及无机元素等功效物质含量进行分析,并在此基础上对其产地差异进行评价,以期较为系统地阐明不同产地山羊角中资源性化学成分的组成与含量差异,为其药用价值的揭示提供数据支持,为药用山羊角产区选择提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC系统(包括四元泵溶剂系统,在线脱气机和自动进样器，美国Waters公司)；Xevo TQ检测器(美国Waters公司);MassLynxTM质谱工作站软件(美国Waters公司);NEXION 350D电感耦合等离子体质谱仪(美国Perkin Elmer公司);Enspive多功能酶标仪(美国Perkln Elmer公司);DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);VX-Ⅱ多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司);D3024R高速冷冻离心机(大龙医疗设备有限公司);BT125D电子分析天平(德国Sartorius公司);QY-2B中药切片机(温州顶历医疗器械有限公司);FMS小型气流式超细粉碎机(北京锟捷玉诚机械设备有限公司);Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 试剂

对照品:L-精氨酸(批号：20090318)、L-苯丙氨酸(批号：20090316)、L-谷氨酸(批号：20090316)、L-缬氨酸(批号：20090318)、L-组氨酸(批号：20090110)均购自上海惠兴生化试剂有限公司;L-谷氨酰胺(批号：C11144809)、L-赖氨酸(批号：C10914803)、L-异亮氨酸(批号：C11435950)、L-天冬氨酸(批号：C11512944)、L-色氨酸(批号：C11475362)、L-丝氨酸(批号：C11583738)、L-酪氨酸(批号：C10874374)、L-亮氨酸(批号：C11495324)、L-苏氨酸(批号：C11584158)、L-半胱氨酸(批号：C11768775)均购自上海麦克林生化科技有限公司;胸苷(批号：1001182663)、胞苷(批号：1446223)、肌苷(批号：086K1243)、胸腺嘧啶(批号：1000735425)、鸟苷(批号：119K15841V)、次黄嘌呤(批号：101K0022)、L-瓜氨酸(批号：BCBC7694)、γ-氨基丁酸(批号：BCBD3661V)均购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司;2′-脱氧腺苷(批号：101144695)、2′-脱氧肌苷(批号：1001182663)、2-氯苯丙氨酸(批号：D2029087)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲硫氨酸(批号：F20080927)购自上海国药集团化学试剂有限公司。

硝酸(优级纯,批号：20220105)、双氧水(优级纯,批号：180827)、硼氢化钠(批号：20120302)购自上海国药集团化学试剂有限公司;砷(As)、镁(Mg)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铅(Pb)、铜(Cu)、锌(Zn)、镉(Cd)和锡(Sn)的多元素标准溶液(100 μg·mL-1，批号：GSB 04-1767-2004)；单元素标准溶液磷(P，批号：GSB 04-1741-2004 a)、钙(Ca，批号：GSB 04-1720-2004)、钠(Na，批号：GNM-SNA-002-2013)和钾(K，批号：GNM-SK-002-2013)均为1 000 μg·mL-1,单元素标准溶液钼(Mo)、铟(In)和铑(Rh)均为100 μg·mL-1，均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心;BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：20220723)购自北京索莱宝科技有限公司;屈臣氏蒸馏水。

甲醛溶液(批号：13080211122)购自南京化学试剂有限公司;5, 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB,批号：C20PA6091)和1.5 mol·L-1Tris-HCl缓冲液(批号：TU1124)购自南京翼飞雪生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA-2Na,批号：J09GS151076)购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱级,购自德国Merck公司;甲酸(批号：C11901830),购自美国ACS公司;甲酸铵(批号：BCBX5107)和乙酸铵(批号：BCBV8695)均购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司;氯化钠(批号：A2104123)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;超纯水为实验室自制。

1.3 样品

山羊角样品于2021年11月至2022年2月采自江苏、山东、内蒙古、山西、河北、广西、云南等省区,共32批次。样品经南京中医药大学段金廒教授鉴定均为牛科动物山羊CaprahirusLinnaeus的角。凭证标本存放于南京中医药大学江苏省中药资源产业化创新协同中心标本室。样品采集后,洗净取出骨塞,晾干后镑片粉碎,过40目筛,密封干燥保存备用,样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 核苷类及氨基酸类成分分析

2.1.1 对照品溶液制备 取干燥至恒质量的27种对照品适量,精密称定,溶于10%甲醇溶液配制成化合物1～27(表2)质量浓度分别为0.120、0.100、0.109、0.107、0.102、0.092、0.104、0.108、0.196、0.201、0.101、0.115、0.118、0.143、0.117、0.124、0.183、0.126、0.101、0.152、0.212、0.114、0.107、0.111、0.132、0.159、0.187 mg·mL-1的混合对照品储备液。再将混合的对照品储备溶液稀释到一系列适当的浓度,摇匀,溶液经0.22 μm的微孔滤膜滤过,续滤液作为对照品溶液。精密称定4 mg内标(IS)2-氯苯丙氨酸,加10%甲醇溶液配制成质量浓度为40 μg·mL-1的IS储备液,后稀释至4 μg·mL-1冷藏备用。将上述系列浓度对照品溶液各吸取950 μL加入50 μL IS溶液配成含IS的系列浓度对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取样品粉末1.0 g,精密称定,置于25 mL具塞锥形瓶中,精密加入15 mL纯水,室温静置过夜,室温超声(40 kHz)提取3次,每次40 min,称质量,加水补足减失质量,摇匀,3 000 r·min-1离心15 min,取上清液3 mL,加乙腈9 mL,摇匀,冷藏过夜,3 000 r·min-1离心15 min。取上清液8 mL,真空离心浓缩,残渣加1 mL 50%乙腈溶解,13 000 r·min-1离心15 min,取上清液,经0.22 μm微孔滤膜滤过后,取续滤液作为供试品溶液。精密吸取各供试品溶液950 μL加入50 μL IS溶液配成含IS的供试品溶液。

2.1.3 UHPLC-MS/MS色谱分析条件 色谱柱:ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:A(含5 mmol·L-1甲酸铵、5 mmol·L-1乙酸铵和0.2%甲酸的水溶液)和B(含1 mmol·L-1甲酸铵、1 mmol·L-1乙酸铵和0.2%甲酸的乙腈溶液)。梯度洗脱程序:0～3 min,10%A;3～9 min,10%～18%A;9～15 min,18%～20%A;15～16 min,20%～46%A;16～18 min,46%A;18～20 min,46%～10%A。流速:0.40 mL·min-1,柱温:30 ℃,进样量:1 μL[12]。

2.1.4 UHPLC-MS/MS质谱分析条件 离子化模式:ESI+;检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:3.0 kV;离子源温度：150 ℃;脱溶剂气温度:500 ℃;脱溶剂气流速:1 000 L·h-1;碰撞气流量:0.15 mL·min-1;锥孔气流量:50 L·h-1。27种被测物质及IS质谱参数见表2,MRM色谱图见图1。

2.1.5 线性关系、检测限和定量限 按2.1.1项下方法制备不同浓度的混合对照品溶液,按2.1.3项下色谱条件和2.1.4项下质谱条件测定混合对照品,分别以各对照品峰面积与对应IS峰面积的比值为纵坐标(Y),以各对照组溶液的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),制作标准曲线,计算相关系数(r);将峰高除以背景噪声值作为信噪比(S/N),S/N分别为3和10时,获得了27种化合物的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。线性方程、LOD和LOQ结果见表3,结果显示r在0.998 4～1.000 0,表明各化合物在测定范围内线性良好。

表3 27种对照品线性关系考察

2.1.6 方法学考察 对实验中各成分均进行精密度、稳定性、重复性及加样回收率考察。结果显示各成分日内精密度RSD在1.46%～4.96%,日间精密度RSD在0.61%～4.99%;重复性试验RSD在1.56%～5.24%;稳定性试验RSD在1.75%～5.89%;平均回收率在95.41%～107.13%,RSD在1.47%～6.00%。上述结果提示本实验建立的分析方法可用于山羊角样品中相关成分的分析评价。

2.1.7 样品测定结果及分析 所测样品中共检测到18种游离氨基酸类成分,其中γ-氨基丁酸0.11～1.55 μg·g-1、丝氨酸20.62～213.65 μg·g-1、缬氨酸35.62～83.62 μg·g-1、苏氨酸20.50～76.75 μg·g-1、亮氨酸33.46～80.46 μg·g-1、异亮氨酸19.25～86.04 μg·g-1、天冬酰胺0.08～1.43 μg·g-1、天冬氨酸1.98～17.36 μg·g-1、赖氨酸3.73～36.79 μg·g-1、谷氨酰胺0.05～0.33 μg·g-1、谷氨酸1.04～46.95 μg·g-1、甲硫氨酸0.53～7.64 μg·g-1、组氨酸5.49～75.82 μg·g-1、苯丙氨酸26.15～82.83 μg·g-1、精氨酸49.37～344.05 μg·g-1、瓜氨酸0.34～11.91 μg·g-1、酪氨酸36.47～125.48 μg·g-1、色氨酸5.50～25.28 μg·g-1。各产地氨基酸类成分含量测定结果见图2。氨基酸类成分平均总质量分数达642.41 μg·g-1,其中所测8种人体必需氨基酸占总氨基酸的41.22%。不同产地样本中氨基酸类成分总含量差异较大,其中江苏南通样品(S13)氨基酸总含量(1 023.87 μg·g-1)较高,是广西南林样品(S6)氨基酸总含量(331.69 μg·g-1)的3.09倍。华东地区氨基酸类成分平均含量(826.10 μg·g-1)较高,华北地区次之(550.41 μg·g-1),西南地区(405.57 μg·g-1)较低。对于不同氨基酸成分,各样品中精氨酸(22.73%)、丝氨酸(11.63%)、酪氨酸(10.37%)占总氨基酸的平均质量分数较高。

所有样品中共检测到9种核苷类成分,其中胞嘧啶0.44～1.03 μg·g-1、胸腺嘧啶2.51～6.21 μg·g-1、次黄嘌呤1.22～9.46 μg·g-1、胸苷0.63～17.38 μg·g-1、胞苷0.12～1.23 μg·g-1、2′-脱氧腺苷0.002～0.058 μg·g-1、2′-脱氧肌苷0.11～0.31 μg·g-1、肌苷0.19～3.06 μg·g-1、鸟苷0.13～6.91 μg·g-1。结果见图3,核苷类成分平均总质量分数达20.88 μg·g-1,不同产地样品中核苷类成分总含量差异较大,其中江苏镇江样品(S14)核苷总含量(29.21 μg·g-1)较高,是内蒙古乌审旗样品(S26)核苷总含量(10.19 μg·g-1)的2.9倍;不同地区核苷类成分平均含量总体差异较小。各样品中胸苷(40.73%)和次黄嘌呤(20.68%)占总核苷的平均质量分数较高。

2.2 水溶性蛋白成分分析

2.2.1 对照品溶液制备及标准曲线的建立 根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书中工作液配制方法配制BCA工作液。将5 mg·mL-1的BSA标准品用PBS稀释至0.5 mg·mL-1,将稀释的BSA标准品按0、2、4、6、8、12、16、20 μL加到96孔板的蛋白标准孔中,加PBS补足至20 μL,配成质量浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的系列浓度对照品溶液。

在各蛋白标准孔加入200 μL BCA工作液,37 ℃振荡15 min后于562 nm处测定吸光度,以BSA的浓度(mg·mL-1，X)为横坐标,吸光度为纵坐标(Y),绘制标准曲线,水溶性蛋白的回归方程为Y=0.874 7X+0.020 1(r=0.998 1),结果显示水溶性蛋白在0.05～0.50 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.2 供试品溶液制备及测定 精密称取样品5 g,加入10倍量水,煎煮2次,每次煎煮4 h。合并提取液,趁热抽滤,定容至100 mL,过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液即得,备用。精密吸取各产地山羊角供试溶液适量,用PBS溶液稀释8倍,取样品稀释液20 μL加于96孔板的样品测定孔中,加入200 μL BCA工作液,37 ℃振荡15 min后于562 nm处测定吸光度,根据蛋白标准曲线计算不同产地山羊角的水溶性蛋白含量。

2.2.3 精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验 对实验中各种检测方法均进行精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验考察。结果显示,精密度、稳定性、重复性试验RSD值分别为1.20%、1.77%和0.87%,加样回收率平均值为103.33%,RSD为4.63%,表明本方法准确可靠,可用于山角羊中水溶性蛋白的分析。

2.2.4 样品含量分析 具体结果见表4,水溶性蛋白平均含量为51.07 mg·g-1,其中河北武安样品(S22)的水溶性蛋白含量较高,云南罗平样品(S4)的水溶性蛋白含量较低。华东地区产山羊角水溶性蛋白平均含量(58.79 mg·g-1)较高,华北地区产样品水溶性蛋白平均含量(53.50 mg·g-1)次之,西南地区产样品水溶性蛋白平均含量(28.20 mg·g-1)较低。

表4 不同产地山羊角水溶性蛋白含量(n=3)

2.3 含巯基化合物含量分析

2.3.1 对照品溶液的制备 取L-半胱氨酸24.2 mg,精密称定,加水定容至10 mL配制成20.0 mmol·L-1的溶液,再用纯水分别稀释至10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17 mmol·L-1。

2.3.2 供试品溶液的制备 同2.2.2项供试品溶液制备方法。

2.3.3 工作液的制备 精密称定硼氢化钠3.78 mg,溶于50%甲醇溶液,定容至10 mL,配成10.0 mmol·L-1的硼氢化钠溶液;精密称定氯化钠5.85 mg,加50%甲醇溶液定容至10 mL,配成10.0 mmol·L-1的氯化钠溶液;精密称定EDTA-2Na固体380 mg,用Tris-HCl缓冲液(pH=8.6)溶解后,加入50 μL甲醛溶液,配成10.0 mmol·L-1的EDTA溶液; 精密称定DTNB固体39 mg,加纯甲醇溶液定容至10 mL,配成10.0 mmol·L-1的DTNB溶液[13]。

2.3.4 标准曲线的建立

2.3.4.1 游离巯基 精密吸取氯化钠溶液15 μL与浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17 mmol·L-1的L-半胱氨酸对照品溶液至96孔细胞培养板中,振摇混匀后加入165 μL EDTA溶液,再加入15 μL DTNB溶液,室温静置15 min后于412 nm处测定吸光度,以-SH的浓度(1 mol的L-半胱氨酸中含有1 mol的-SH)为横坐标(X),吸光度为纵坐标(Y),绘制标准曲线,游离巯基的回归方程为Y=0.148 7X+0.136 2(r=0.999 5),结果显示游离巯基在0.16～20.00 mmol·L-1范围内线性关系良好。

2.3.4.2 总巯基 精密吸取硼氢化钠溶液15 μL与浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17 mmol·L-1的对照品溶液至96孔细胞培养板中,其他步骤与2.3.4.1项下相同,总巯基的回归方程为Y=0.180 7X+0.221 5(r=0.999 8),结果显示总巯基在0.16～20.00 mmol·L-1范围内线性关系良好。

2.3.5 方法学考察 对实验中各种检测方法均进行精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验考察。结果各指标均符合定量测定要求,具体结果见表5。

表5 含巯基类化合物含量测定方法考察结果(n=6)

2.3.6 样品测定结果及分析 不同产地山羊角含巯基类化合物测定结果见图4。结果显示,游离巯基平均含量为9.97 μmol·g-1。其中山东菏泽样品(S19)的游离巯基含量(20.38 μmol·g-1)较高,是平均含量的2.04倍;云南昆明样品(S1)的游离巯基含量(4.64 μmol·g-1)较低,是平均含量的0.46倍;西南地区产山羊角样品游离巯基含量普遍低于华东地区及华北地区,其中华东地区产样品游离巯基含量(12.79 μmol·g-1)较高,是西南地区(6.15 μmol·g-1)的2.08倍、华北地区(8.60 μmol·g-1)的1.49倍。所有产地样品的总巯基含量均大于游离巯基含量,总巯基的平均含量为22.48 μmol·g-1,是游离巯基平均含量的2.25倍。其中山东菏泽样品(S19)的总巯基含量(44.48 μmol·g-1)较高,是平均含量的1.98倍;云南昆明禄劝样品(S2)的总巯基含量(12.39 μmol·g-1)较低,是平均含量的0.55倍;不同区域样品中总巯基平均含量规律为华东地区(28.42 μmol·g-1)>华北地区(20.28 μmol·g-1)>西南地区(12.97 μmol·g-1)。不同产地、不同区域样品中总巯基与游离巯基含量变化规律一致。

2.4 无机元素类成分分析

2.4.1 对照品溶液制备 分别精密吸取各元素标准溶液适量,用2%硝酸溶液逐级稀释Mg、Ca、P、Na、K、Cr、Mn、Fe、Ni、Zn、Sn、Cu、Cd、Pb、As、Si、Co和Mo混合标准溶液至1 000、800、400、200、100、50、25、10、5、1、0.25、0.13 ng·mL-1。In和Rh配制成质量浓度为20 ng·mL-1的混合IS溶液。各元素的回归方程、r以及线性范围见表6。

表6 18种元素线性关系和方法学考察

2.4.2 供试品溶液制备 精密称取山羊角粉末0.2 g于聚四氟乙烯消解罐中,加入5 mL硝酸、2 mL过氧化氢,静置10 min,待反应不剧烈,密封后放入电热恒温鼓风干燥箱中,于170 ℃下进行12 h的密闭消解,待消解完全后,取出消解罐置于通风橱中降温,温度降至室温时打开消解罐并在通风橱中将酸挥干,消解液转移至50 mL量瓶中,加2%硝酸定容至刻度,摇匀,即得供试品溶液,其中由于P、Ca、Mg、Na、K常量元素含量过高,将供试品溶液用2%硝酸稀释1 000倍用于上述常量元素的测定。同步以5 mL硝酸、2 mL过氧化氢做空白试验。所有容器及量器用之前均用30%硝酸浸泡[14]。

2.4.3 测定条件 样品溶液注入NEXION电感耦合等离子体质谱仪进行测定,测定条件:等离子体射频功率1 500 W;冷却气流速15 L·min-1,载气为高纯氩气,载气流速0.8 L·min-1,辅助气流速0.2 L·min-1,采样深度9.5 mm;蠕动泵0.3 r·min-1,一次读数时间5 s;进样延时30 s;泵速15 r·min-1。

2.4.4 精密度、重复性、稳定性 对实验中各种检测方法均进行精密度、稳定性及重复性试验考察。结果各指标均符合定量测定要求,具体结果见表6。

2.4.5 样品测定结果及分析 本方法测定的18种元素可分为常量元素、必须微量元素、重金属元素。由图5可知,在测定的5种常量元素中,Ca(21.39～34.23 mg·g-1)含量最高,Mg(1.52～4.06 mg·g-1)含量最低。不同产地之间,内蒙古赤峰样品(S25)的Ca含量最高(34.23 mg·g-1),约为平均含量的1.33倍,山东沂源样品(S20)的Ca含量最低(21.39 mg·g-1),约为平均含量的0.83倍;内蒙古赤峰样品(S25)的Mg含量最高(4.06 mg·g-1),约为平均含量的1.53倍,云南昆明禄劝样品(S2)的Mg含量最低(1.52 mg·g-1),约为平均含量的0.58倍。

由图6可知,在测定的9种必须微量元素中,Fe(34.28～401.78 μg·g-1)和Mn(0.99～24.09 μg·g-1)含量较高,Fe在西南地区山羊角样品中平均含量达380.14 μg·g-1,占比60.75%,远高于华东(23.06%)和华北地区(23.69%);西南地区山羊角中Mn含量(22.72 μg·g-1)是华东地区(1.25 μg·g-1)的18.50倍、华北地区(1.55 μg·g-1)的14.61倍;所测9种必须微量元素总量在西南地区(625.65 μg·g-1)最高,是华东地区(186.32 μg·g-1)的3.36倍、华北地区(257.31 μg·g-1)的2.43倍。

在测定的4种重金属元素中,Cu(3.77～6.12 μg·g-1)平均含量最高,Pb(1.14～2.74 μg·g-1)和Cd(1.65～1.86 μg·g-1)平均含量次之,As(0.01～0.34 μg·g-1)在大部分样品中有微量存在,具体结果见图7。在不同产地样品中,西南地区的样品Cu、Pb、Cd元素含量远高于华东、华北地区,其山羊角中重金属总含量(10.86 μg·g-1)最高,是华东地区(6.89 μg·g-1)的1.56倍、华北地区(7.20 μg·g-1)的1.52倍。参考2020年版《中国药典》中药材重金属含量限定及TraditionalChinesemedicine-determinationofheavymetalsinherbalmedicinesusedintraditionalChinesemedicine(ISO 18664-2015)[15-16],对不同产地山羊角药材的重金属含量进行限定,其中,Pb不得超过5 mg·kg-1、As不得超过2 mg·kg-1、Cu不得超过20 mg·kg-1、Cd不得超过1 mg·kg-1,本实验所测所有批次山羊角中重金属含量均符合药典规定。

2.5 多类型资源性化学成分产地差异分析

为探讨不同地区产山羊角多类型资源性化学成分含量的产地差异,挖掘可用于不同地区区分的潜在指标成分,本研究将所测定的32批山羊角样品的48种化学成分含量导入SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别(PLS-DA)等多变量统计分析。如图8A所示,所有样品被分为3类,在一定程度上反映了不同地区的山羊角成分存在一定的差异。来自华东和华北地区的样品相对较近且有重合部分,来自西南地区的样品与其他地区的样品距离较远,呈现完全分离状态,提示西南地区的样品中多类型资源性化学成分整体特征与华东、华北地区样品有较大差异。进一步建立有监督的PLS-DA模型,结果见图8B,3个产地可以完全区分开;采用200次随机置换检验考核PLS-DA模型的适用性(图8C),R2=0.038 8,Q2=-0.512,说明该模型未发生过拟合,是可靠的分类判别模型[17];根据VIP值结合PLS-DA载荷图,图8D表明丝氨酸、Si、胸苷、Mn、Fe、Cu、Ca、天冬酰胺、苏氨酸和游离巯基等成分的VIP均大于1,为组间主要差异贡献成分。

根据上述PCA结果,以主成分特征值大于1为标准,挑选出6个主成分,特征值分别为12.2、3.62、2.89、2.28、1.79、1.68,方差贡献率分别为38.3%、11.3%、9.03%、7.11%、5.61%、5.26%,累积方差贡献率为76.6%。以6个主成分得分与其方差贡献率乘积之和,得出32批不同产地山羊角样品多类型资源型化学成分总主成分因子得分值(F),结果见表7,华东地区的山羊角综合评分排列前8名,提示就所测48种资源型化学成分而言,华东地区山羊角质量较好,但同产地山羊角各类成分含量综合评分差异较大,如山东临沂山羊角样品(S16)综合评分远高于山东沂源(S20)综合评分。

表7 不同产地山羊角各类成分含量综合评分结果

3 讨论

角类药材多含有丰富的蛋白质及氨基酸类、核苷类物质,本实验分析不同产地山羊角上述成分含量,发现华东地区水溶性蛋白、核苷及氨基酸类成分总含量较高,华北地区次之,西南地区含量相对较低;山羊角中富含精氨酸、酪氨酸、丝氨酸等成分,可被研究作为氨基酸补充剂。蛋白质是生命活动的基本物质,可补充营养并提供丰富的功能特性[18],可被研究作为蛋白补充剂。

无机元素可与体内的氮、氧、硫的配体形成配位键,参与体内代谢与平衡[19]。本实验分析结果显示不同产地山羊角元素种类、含量丰富。研究表明热性惊厥模型大鼠发作时,血浆中Ca2+浓度下降,及时补充Ca2+可使惊厥阈值下降,进而达到抗惊厥功效[20-21],本实验所测不同产地山羊角无机元素中Ca含量最高,提示山羊角抗惊厥功效可能与之相关。此外，K、Na、P等常量元素可在预防骨质疏松、调节神经、镇痛、催眠及参与骨髓造血系统生理过程[22]等方面发挥潜在作用,是山羊角相应功效发挥的潜在效应物质之一。

重金属具有较长的生物半衰期和不可生物降解性,会在人体肝、肾等不同部位长期积累[23]。本实验所测4种重金属元素总含量均符合药典规定,但西南地区产山羊角重金属含量远高于其他地区样品,此现象可能与我国土壤的重金属分布规律有关:Cd、Hg、Pb、As等有害元素含量分布呈现从东北到西南逐渐升高的态势[24],其中Cd等重金属元素在贵州、广西等西南岩溶地区土壤的平均含量远高于全国平均水平[25]。据此推测,西南地区所产山羊角中重金属含量较高与该区域饮水和饲料富含重金属导致动物体内蓄积相关。研究表明在饲料中添加高铜成分可提高家禽体质量[23],这也可能是导致山羊角中Cu元素含量较高的原因之一。重金属元素的测定可为山羊角药材的质量控制、安全性评价提供依据。

近年来,巯基及活性硫簇因与多种生物效应及疾病相关而受到广泛关注,在惊厥及发热动物模型中血浆巯基含量在给予山羊角后显著升高,表明山羊角的抗惊厥及解热效应可能与巯基含量有关[6,26]。本实验结果表明华东地区样品中游离巯基、总巯基含量较高,西南地区样品含量较低,后续可探讨不同产地山羊角药理活性与巯基含量的内在联系。

根据PCA结果发现西南地区山羊角被显著分开,华东与华北地区样品略有重叠,从地理位置来看,西南地区属于亚热带季风性湿润气候,而华东与华北地区地理位置相对较近。土壤环境、水源等因素导致山羊的生长环境具有显著差异,进而使山羊角的资源型化学成分含量具有地域性差异,可为山羊角药用产地选择提供数据支持,为山羊角药材原料的资源供给和品质稳定提供数据支持。

山羊角作为我国山羊产业深加工的下脚料被大量废弃,造成了资源浪费和环境污染[1]。基于中药资源化学多层次、多途径、精细化利用的研究思路[27],深入挖掘其药用价值和多途径资源利用前景,必将会为稀缺角类动物药的类效替代资源开发、山羊角资源的合理综合利用与产业发展提供科学依据,为我国山羊产业链延伸做出应有的贡献。