微小RNA-370-3p和Toll样受体4在结直肠癌组织中的表达及临床意义

李博文 韩元圣 黄高俊 郑磊

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球第3大多发性肿瘤，也是第2大癌症死亡病因[1-2]。目前，结直肠癌的临床治疗仍以手术为主，放疗、化疗为辅。发病早期多无明显症状，多数病人确诊时已是晚期，导致预后较差。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种诊断、治疗及与结直肠癌病理发展相关的非编码小RNA[3]。在众多miRNA中，miR-370-3p位于人类14号染色体，参与神经胶质瘤、甲状腺癌、膀胱癌、卵巢癌、胆管癌等多种肿瘤发病过程[4]。Shen等[5]研究结果显示，miR-370在结直肠癌病人癌组织中下调表达，并抑制癌细胞的增殖、促进凋亡。Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)是炎症、先天免疫、传染病及炎症介导的肿瘤发生的主要成分[6]。TLR4是TLR家族的关键成员，也是炎症反应的重要因子。研究表明，多种肿瘤中均检测到TLR4的异常高表达，并且参与调控癌细胞增殖、侵袭等过程[7]。此外，miR-370-3p还能够调控炎症相关信号通路，降低IL-6、IL-1β、TLR4等炎症因子的表达[8]。Zhang等[8]研究表明，在急性期肺炎病人血清TLR4表达上调，miR-370-3p表达下调，两者呈负相关。进一步研究发现，TLR4是miR-370-3p的靶基因。本研究检测miR-370-3p、TLR4在结直肠癌组织中的表达水平，并分析其临床意义。

对象与方法

一、对象

2016年1月～2018年6月在本院肛肠外科行手术治疗的结直肠癌病人146例，术中收集切除的癌组织标本及癌旁组织(距癌组织超过5 cm)。男79例，女67例，年龄<60岁62例， ≥60岁84例，TNM期中81例Ⅰ+Ⅱ期、65例Ⅲ+Ⅳ期。所有研究对象均属于首次确诊原发性结直肠癌，且术后病理检查证实为结直肠癌。排除标准：术后失访；伴有其他恶性肿瘤；入院前有放疗、化疗史；有全身感染性疾病；合并有结肠穿孔、肠道结核等肠道部位疾病。术后随访3年，每6个月固定以电话或病人就医复诊形式进行，时间截止至2021年6月。该研究经医院伦理委员会审核并批准，研究对象自愿参加。

二、方法

1.实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 检测miR-370-3p和TLR4表达水平：从-80 ℃取出组织标本，经研磨后使用试剂盒提取总RNA，然后在微量核酸分析仪上测定RNA质量；使用PrimeScript RT试剂盒进行逆转录；使用SYBR Green染料在ExicyclerTM 96实时荧光检测系统采集信号。miR-370-3p以U6为内参，TLR4以β-actin为内参，所有序列均送至上海吉玛制药技术有限公司合成，引物具体序列及来源均列于表1。采用2-△△Ct法计算表达量。

表1 引物序列

2.免疫组化法检测TLR4蛋白表达水平：取石蜡包埋的组织切成5 μm厚的切片，二甲苯脱蜡后，酒精水化；加热收回抗原，然后逐步加入3% H2O2，山羊血清封闭；加入TLR4一抗过夜孵育；加山羊抗兔IgG二抗再次孵育；DAB显色，苏木精复染，最后在光学显微镜下观察结果。由两名研究人员对免疫染色进行评分，TLR4蛋白显色于细胞膜和细胞质。具体评估标准见表2。最后根据评分结果分为低表达组(≤4分)、高表达组(≥5分)。

表2 染色评分表

三、统计学分析

结果

1.miR-370-3p和TLR4 mRNA表达水平：结直肠癌组织中miR-370-3p表达水平低于癌旁组织；TLR4在癌组织中的mRNA表达水平高于癌旁组织，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 miR-370-3p和TLR4表达水平比较

2.TLR4蛋白表达水平比较：TLR4在结直肠癌组织中的高表达率为40.41%，在癌旁组织中高表达率为13.01%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 TLR4在各组织中免疫组化染色情况(苏木素染色 ×400)

3.癌组织中miR-370-3p、TLR4表达水平与结直肠癌病人临床病理特征分析：以癌组织中miR-370-3p表达水平平均值为界限，将结直肠癌病人分为miR-370-3p高表达组(82例)和低表达组(64例)；TLR4的免疫组化结果显示，其高表达组为59例，低表达组为87例。miR-370-3p、TLR4不同表达水平与病人脉管浸润、年龄、性别、肿瘤部位、神经浸润、肿瘤直径无显著相关性(P>0.05)，与TNM分期、分化程度、淋巴结转移存在差异(P<0.05)。见表4。

表4 miR-370-3p、TLR4表达水平与病人临床病理特征的关系比较(例)

4.miR-370-3p与TLR4的相关性分析：Targetscan预测显示miR-370-3p与TLR4存在结合位点，见图2。Pearson分析结果显示，结直肠癌组织中miR-370-3p与TLR4呈负相关(r=-0.760，P=0.000)。见图3。

图2 miR-370-3p序列中含有与TLR4互补的核苷酸序列

图3 miR-370-3p与TLR4的相关性分析

5.结直肠癌病人预后不良多因素Cox回归分析：以单因素分析中有差异的miR-370-3p、TLR4、TNM分期、分化程度、淋巴结转移为自变量，以结直肠癌病人预后不良作因变量进行Cox回归分析，结果显示miR-370-3p、TNM分期、分化程度、TLR4、淋巴结转移均是影响预后的因素(P<0.05)。见表5。

表5 Cox回归分析影响病人预后的因素

6.miR-370-3p、TLR4表达水平与病人生存时间的关系：所有病人术后随访3年，146例病人中95例存活，51例死亡，总生存率为65.07%。miR-370-3p高表达组病人的3年累积生存率(78.05%)显著高于miR-370-3p低表达组(48.44%)(Log-rank χ2=14.309，P=0.000)。TLR4低表达组累积生存率为73.56%高于TLR4高表达组(52.54%)(Log-rank χ2=6.765，P=0.009)。见图4。

图4 miR-370-3p、TLR4表达水平与病人生存时间的关系

讨论

结直肠癌约占全球癌症死亡人数的10%，其中女性病人的发病率及死亡率比男性低25%[11]。病理早期的病人预后效果较好，随着病情加重，晚期病人的预后较差。如果发生肿瘤转移，将会进一步损害消化系统、骨骼、肺、肝、淋巴等[11-12]。结直肠癌是一种多因素癌症，使用结肠镜检查进行的早期筛查和对分子机制的了解有助于降低其发生率和死亡率。针对血管内皮生长因子受体(VEGFR)的抗体已应用于临床治疗，寻找与结直肠癌有关的分子标志物对改善预后至关重要[13]。

miRNA在肿瘤细胞分化中具有潜在的应用价值。多项研究表明，miR-370-3p参与膀胱癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、胆管癌、卵巢癌等肿瘤发病过程[4]。Shen等[5]的结果显示，miR-370在结直肠癌组织中表达下调，并且miR-370的表达水平与肿瘤分级呈负相关，通过抑制癌细胞增殖、促进凋亡在结直肠癌中起抑癌作用。在膀胱癌中miR-370表达下调，并与肿瘤恶性转化高度相关，过表达miR-370能有效阻止癌细胞转移，miR-370通过靶向SOX12对膀胱癌产生抑制作用[14]。本研究结果表明，与癌旁组织相比，miR-370-3p在癌组织表达水平降低，并与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移存在明显相关性，说明miR-370-3p可反映病情严重程度，与结直肠癌进展密切相关。

TLR是一类在免疫细胞和上皮细胞中表达的模式识别受体，能引发信号转导，释放炎性介质，并在免疫反应中起着重要作用。有研究证实，肿瘤周围的炎性反应也是促进肿瘤发展的必要因素[15]。一项Meta分析结果显示，TLR3、TLR4、TLR9的高表达与肿瘤病人预后相关，TLR3高表达与病人预后良好相关，TLR4高表达与晚期病人预后不良有关，而TLR9与早期肿瘤病人的预后不良有关[16]。其中，TLR4定位于人17号染色体，不仅能促进炎症反应的发生，还能诱导细胞分化、增殖，并且能通过多种途径参与调控肿瘤发生、发展。TLR4表达上调与前列腺癌较高的复发率、乳腺癌的肿瘤大小和远处转移、卵巢癌病人较低的生存率有关[17]。杨湘等[18]在喉癌组织中检测到TLR4高表达，其表达水平与临床分期、浸润程度、分化程度及淋巴结转移有关。Beilmann-Lehtonen等[17]的免疫组化结果显示，在结直肠癌组织中TLR4高表达与病人较差预后相关。结合本研究结直肠癌组织中TLR4 mRNA及蛋白水平均上升，进一步证实了TLR4在结直肠癌中的高表达。本研究还发现，TLR4表达水平与TNM分期、肿瘤分化、淋巴结转移程度相关，说明TLR4参与结直肠癌发展过程。

此外，miRNA也是体内炎症信号的重要调节剂，并参与人类多种炎症疾病过程。Lin等[4]在溃疡性结肠炎小鼠模型中发现，miR-370-3p通过靶向TLR4和β-catenin对炎症反应产生抑制作用，降低了小鼠的死亡率和肿瘤发生。Tian等[19]研究发现，miR-370-3p通过靶向TLR4来减少炎症反应及氧化应激，从而抑制动脉粥样硬化。本研究结果表明，癌组织中miR-370-3p与TLR4呈负相关，提示miR-370-3p、TLR4共同参与了结直肠癌病理过程，但其中的机制尚需进一步研究。本研究的Cox分析结果显示，miR-370-3p、TNM分期、淋巴结转移、TLR4、分化程度均是影响结直肠癌病人预后的因素(P<0.05)。生存曲线分析发现，miR-370-3p高表达、TLR4低表达的病人3年累积生存率分别显著高于miR-370-3p低表达、TLR4高表达病人，说明miR-370-3p表达水平高、TLR4表达水平低时结直肠癌病人预后较好。

综上所述，结直肠癌组织中miR-370-3p低表达、TLR4高表达，miR-370-3p与TLR4呈负相关性，二者表达水平均可影响病人预后。当miR-370-3p高表达、TLR4低表达时病人累积生存率较高。本研究纳入的样本量有限，研究对象存在地域、生活环境等的局限性，后期将扩大样本继续研究影响预后的因素以及miR-370-3p与TLR4调控结直肠癌发病的具体机制。