响应面法优化乌梅复合饮料的制备工艺
2022-10-17左亚锋李艳冉李逸喆
左亚锋，王 成，李艳冉，李逸喆，王 娜，汤 建
（1.亳州学院；2.亳州市华佗中医院，安徽 亳州 236800）
乌梅来源于蔷薇科植物梅的干燥近成熟果实，药用历史悠久，具有敛肺涩肠、生津止渴、驱虫止痢的功效[1,2]。研究发现乌梅含有萜类、黄酮类等多种活性成分，具有抗肝纤维化、抑菌、降血脂等功能[3-5]。
木瓜具有舒筋络、和脾胃的功效，现代研究表明木瓜中含有黄酮类、有机酸类、甾体类、三萜类等化合物，具有抗肿瘤、保肝、免疫调节、抗菌等多种生物活性[6-8]。紫苏叶具有药食两用的特点，主要有抗氧化，解热，镇痛等药理作用[9-11]。炙甘草补脾和胃、益气复脉力胜，具有抗氧化损伤、镇痛、解毒等药理作用[12]。本试验以乌梅、木瓜、紫苏叶和炙甘草为主要原材料，并通过调节加入量来优化口感，进而使原材料在风味和功效方面共同提高。乌梅、木瓜、紫苏叶和炙甘草同为药食同源的品种[13]，因此，本研究采用相关试验来进行饮料研制和其配方工艺优化，研制以乌梅、木瓜、紫苏叶和炙甘草为原料的具有一定解酒作用的乌梅复合饮料[14]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
乌梅饮片、木瓜饮片、紫苏叶饮片、炙甘草饮片均购自安徽协和成药业饮片有限公司。
1.1.2 试剂
DPPH（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、乙醇（分析纯）、H2O2（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；水杨酸钠（分析纯）、七水合硫酸亚铁（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司。
1.1.3 仪器与设备
HZY-C5200电子天平 华志（福建）电子科技有限公司；MJ-PB40E253C加热破壁营养料理机 广东美的生活电器制造有限公司；80-2台式低速离心机 上海手术器械厂；WYA(2WAJ)阿贝折射仪 上海仪电物理光学仪器有限公司；98-Ⅱ-B电子控温磁力搅拌电热套 天津市泰斯特仪器有限公司；DZKW-3-6电热恒温水浴锅 上海科恒实业发展有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电物理光学仪器有限公司
1.2 试验方法
1.2.1 乌梅复合饮料制备工艺流程
图1 工艺流程图
1.2.2 制备过程
1.2.2.1 乌梅浸提液（A）制备流程
乌梅饮片和水按1:4比例混合，在95℃水浴锅中浸提30min，冷却后，打浆机打浆，取打浆液用滤布进行过滤[15,16]。
1.2.2.2 木瓜浸提液（B）制备流程
木瓜饮片和水按1：20比例混合，在95℃水浴锅中浸提2h，冷却后，打浆制得粗浆液，然后过滤，最后离心[17-21]。
1.2.2.3 紫苏叶浸提液（C）制备流程
取紫苏叶饮片20克，研碎，用滤布包裹，加蒸馏水300mL，放入索氏提取装置进行提取2h，冷却，得紫苏叶汁[22,23]。
1.2.2.4 炙甘草浸提液（D）制备流程
炙甘草饮片和水按1∶12比列，在95℃水浴锅中浸提2h，冷却后，打浆制得粗浆液，然后过滤，最后离心[24,25]。
1.2.2.5 乌梅复合饮料制备流程
将得到的浸提液按照一定比例进行混合。本试验以100mL的乌梅复合饮料为实验配制量，选择15%的A、15%B、15%C、10%D作初始值，接着分别设置A、B、C和D的不同浓度，产品品质评价依据设置为感官评分和可溶性固形物含量，最后测试出最佳的添加量[26]。
1.2.3 单因素试验
1.2.3.1 乌梅浸提液（A）添加量的选择
以100mL乌梅复合饮料为实验配制量，选择B添加量15%，C添加量15%，D添加量10%为初始添加量，分别添加7%、11%、15%、19%、23%的A，评价依据为感官评分和可溶性固形物含量，依照评价依据得出最优乌梅饮片浸提液添加量。
1.2.3.2 木瓜浸提液（B）添加量的选择
以100mL乌梅复合饮料为实验配制量，选择A添加量15%，C添加量15%，D添加量10%为初始添加量，分别添加7%、11%、15%、19%、23%的B，评价依据为感官评分和可溶性固形物含量，依照评价依据得出最优木瓜饮片浸提液添加量。
1.2.3.3 紫苏叶浸提液（C）添加量的选择
以100mL乌梅复合饮料为实验配制量，选择15%添加量的A，15%添加量的B，10%添加量的D为初始量，然后设置C添加量分别为7%、11%、15%、19%、23%，以感官评分和可溶性固形物含量为评价依据，确定紫苏叶饮片浸提液添加量最优值。
1.2.3.4 炙甘草浸提液（D）添加量的选择
以100mL乌梅复合饮料为实验配制量，选择15%添加量的A，15%添加量的B，15%添加量的C为初始量，然后分别设置D添加量分别4%、7%、10%、13%、16%的，以感官评分和可溶性固形物含量为评价依据，确定紫苏叶饮片浸提液添加量最优值。
1.2.4 响应面试验设计
根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素实验的基础上，以不同的A、B、C、D添加量为实验因素，且设置评价指标为单因素实验所得的感官评价和可溶性固形物含量的相关数据，然后采用4因素3水平的响应面分析方法优化乌梅复合饮料的配方工艺，进而确定饮料的最佳配方，因素水平表见表1。
表1 响应面因素因素水平表
1.2.5 指标测定
1.2.5.1 可溶性固形物含量的测定
测定方法依据GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》[27]。
1.2.5.2 总酸含量的测定
测定方法依据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[28]。
1.2.6 自由基清除率的测定[29,30]
1.2.6.1 DPPH自由基清除率的测定
取10mL的试管，放入2mL乌梅复合饮料，加入配制好的浓度为2×10-4mol/L的DPPH-80%乙醇水溶液2mL，摇晃数分钟，直至完全混匀，水平放置30min后，使用已经用80%乙醇溶液调零过的，设置在517nm的仪器测定该混合液的吸光度值，且把数值记为A1；另取10mL的试管，放入2mL80%乙醇溶液和2mL DPPH溶液，摇晃数分钟，直至完全混匀，水平放置30min后，相同条件下测该混合液吸光度，把其数值记为A0；再取10mL的试管，放入2mL80%乙醇溶液和2mL乌梅复合饮料，摇晃数分钟，直至完全混匀，水平放置30min后，相同条件下测该混合液吸光度，把其数值记为A2。相同条件下，重复试验三次。使用下列的公式来计算出DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
上式：A0为2mL80%乙醇溶液和2mL DPPH溶液的混合液的吸光度数值；A1为2mL乌梅复合饮料和2mL DPPH-80%乙醇水溶液的混合液的吸光度数值；A2为2mL80%乙醇溶液和2mL乌梅复合饮料的混合液的吸光度数值。
1.2.6.2 总抗氧化（T-AOC）能力的测定
总抗氧化（T-AOC）能力采用试剂盒要求方法进行测定，并根据其给出的标准曲线计算该数值。
1.2.6.3 羟自由基清除率的测定
在0.45mL乌梅复合饮料中加水定容至2mL，然后添加6mmol/L的过氧化氢溶液1.4mL、20mmol/L的水杨酸钠溶液0.6mL和2mL浓度为1.5mmol/L的FeSO4·7H2O溶液，水浴锅设置37℃，把混合液放入其中水浴加热1h。最后使用已经用蒸馏水调零过的，设置在760nm的仪器测定该混合液的吸光度，把其数值记为A，相同条件下，重复试验三次[31,32]。采用下列公式来计算羟自由基清除率。
羟自由基清除率/%=[（A1-A2）/A1]×100
上式：A1为空白吸光度数值的平均值；A2为样品液吸光度数值的平均值。
1.2.7 感官评价
采用百分制，以乌梅复合饮料的色泽（20分）、形态（20分）、口感（40分）和风味（20分）为评分项，挑选十位志愿者，根据下列评分标准对乌梅复合饮料进行全面评价，最终平均十位志愿者的分数为试验结果。感官评分标准见表2。
表2 乌梅复合饮料感官评分标准
1.2.8 数据分析
使用Design-Expert 11软件和Origin8.5软件处理分析单因素试验和响应面试验数据。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验结果
2.1.1 A添加量对乌梅复合饮料品质的影响
图2可以看出，A的添加量在7%～11%时，乌梅复合饮料的感官评分和可溶性固形物含量处于一个向上的发展，感官评分在11%处达到最高值90分，说明此时乌梅复合饮料的色泽、形态、口感和风味较好；但是可溶性固形物含量仍处于向上的发展趋势，由于A添加量不断增加，饮料过酸，十分影响饮料口感，故综合考虑，选择A添加量为11%。
图2 A添加量对乌梅复合饮料品质的影响
2.1.2 B添加量对乌梅复合饮料品质的影响
由图3可以看出，B添加量在7%～15%时，乌梅复合饮料的感官评分和可溶性固形物含量处于一个向上的发展，且都在15%处达到最高值，感官评分89分，可溶性固形物含量2.31%，说明此时的B添加量为最优量且此时饮料浓度最大；而在15%～23%之间，该饮料的感官评分和可溶性固形物含量处于一个向下的发展。所以结合各因素考虑选择B的添加量为15%。
图3 B添加量对乌梅复合饮料品质的影响
2.1.3 C添加量对乌梅复合饮料品质的影响
从图4可以看出，C添加量在7%～19%时，乌梅复合饮料的感官评分和可溶性固形物含量处于一个向上的发展，且都在19%处达到最高值，感官评分88分，可溶性固形物含量2.50%，说明此时的C添加量为最优量且此时饮料浓度最大；而在19%～23%之间，该饮料的感官评分和可溶性固形物含量处于一个向下的发展。结合各因素考虑选择C的添加量为23%。
图4 C添加量对乌梅复合饮料品质的影响
2.1.4 D添加量对乌梅复合饮料品质的影响
从图5可以看出，D添加量在4%～10%时，乌梅复合饮料的感官评分和可溶性固形物含量处于一个向上的发展，且都在10%处达到最高值，感官评分89分，可溶性固形物含量2.50%，说明此时的D添加量为最优量且此时饮料浓度最大；而在10%～16%之间，该饮料的感官评分和可溶性固形物含量处于一个向下的发展。结合各因素考虑考虑选择D的添加量为10%。
图5 D添加量对乌梅复合饮料品质的影响
2.2 响应面分析法优化工艺
2.2.1 响应面试验设计及结果
根据响应面法中的Box-Behnken试验设计方法，以感官评价和可溶性固形物含量为响应值，进行4因素3水平的饮料配方工艺优化试验，试验设计结果见表3。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
2.2.2 回归方程拟合和方差分析
采用DesignExpert 11软件对试验所得的数据处理分析，进而分别得到感官评价和可溶性固形物含量与各因素变量的方程模型：
2.2.2.1 感观评分的回归模型方差分析
从表4统计分析结果可以看出，模型的P值＜0.0001，此数据证明该模型差异极显著，具有统计学意义，方差来源A、C、D、A2、B2、D2的P值均＜0.0001，差异极显著；BD的P值＜0.01差异显著；B、AB、CD、C2的P值＜0.05，依然可以体现统计学意义。由此结果可以证明各个主要因素之间存在一定的交互影响；并且结合得到的回归方程的R2=0.9849说明感官评分由所选因素决定的可能性达到98.49%，且失拟项的P=0.9877＞0.05，这个数据充分体现了此回归方程可以较好地模拟各个试验点，所以此回归方程能够较准确地估计出各个影响因素和感官评分之间的关系，进而确定该复合饮料的最佳配方。
表4 感官评分的回归模型方差分析
2.2.2.2 可溶性固形物含量的模型方差分析
从表5可以看出，模型的P值＜0.0001，证明此模型显著性高，具有统计学意义，方差来源A、C、D、AC、A2、B2、C2的P值均＜0.0001，差异极显著；B、BC的P值＜0.01差 异显 著；AD、BD、D2的P值＜0.05,依然可以体现统计学意义。由此结果可以证明各个主要因素之间存在一定的交互影响；且结合回归方程的R2=0.9878说明感官评分由所选因素决定的可能性达到98.78%，失拟项的P=0.5010＞0.05，这个数据充分体现了此回归方程可以较好地模拟各个试验点，所以此回归方程能够较准确地估计出各个影响因素和可溶性固形物的关系，进而确定该复合饮料的最佳配方。
表5 可溶性固形物方差分析
2.2.3 响应面分析
响应面图形可以立体形象地描述回归方程，其二维平面的等高线图更可以很好地体现各试验因素以及两两因素交互作用对响应值的影响[25]。由图可知，A、D的曲面弯曲程度非常大，B、C的曲面弯曲程度较大，说明这4个因素对感官评分影响显著。由等高线图可知，A和B，B和D，C和D之间的交互作用对感官评分的影响是显著的，其它因素交互作用则不明显，这与方差分析结论相同。同时由响应面图形可知，A、B、C、D的曲面弯曲程度较大，说明这4个因素对可溶性固形物影响显著。由等高线图可知，A和C，A和D，B和C之间的交互作用对感官评分有显著的影响，其它因素则交互不明显，这与方差分析所得的结果相符合。
2.3 验证性试验
根据上述确立的响应面模型，通过Design-Expert11软件得出乌梅复合饮料在感官评分和可溶性固形物都达到最高值的最佳配比是A：B：C：D为11.267：18.000：20.104：12.000，此配比下感官评分数值为94.148分，可溶性固形物含量为2.434%。根据上述结论进行验证性试验，同时考虑操作的可行性，将最佳的工艺条件定位为A：B：C：D为11：18：20：12，此时测得感官评分数值为94.5分，可溶性固形物含量为2.40%，说明该研究优化的配方可靠。
2.4 复合饮料的理化分析
乌梅复合饮料的pH=3.40，酸度为5.76g/kg，可溶性固形物含量为2.40%。
2.5 乌梅复合饮料体外抗氧化能力分析
乌梅复合饮料的DPPH自由基清除率、总抗氧化（T-AOC）能力、羟自由基清除率和如表6所示。
表6 乌梅复合饮料体外抗氧化能力分析
乌梅复合饮料的DPPH自由基清除率为34.77%，总抗氧化（T-AOC）能力为1.21μmol/mL，羟自由基清除率为31.19%，与抗坏血酸对比可知该饮料具有一定的抗氧化效果。
3 结论
本实验以乌梅、木瓜、紫苏叶、炙甘草等为原料，通过单因素和响应面试验，研究乌梅复合饮料的最佳配方。通过响应面优化试验得到的最佳配比为乌梅浸提液11%、木瓜浸提液18%、紫苏叶浸提液20%、炙甘草浸提液为12%。此配方制作的乌梅饮久舒复合饮料呈厚重的褐色中带有红色，汁液透亮澄澈，口感醇厚，具有乌梅、木瓜和紫苏叶各自所独有的风味，具有一定解酒作用保健饮料。
