感染Bt的3龄思茅松毛虫中肠组织病理及血淋巴酶活性分析

邱 雨 杨 斌 吴培福 王宇翔 周杰珑,

（1. 西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650233；2. 西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650233）

思茅松毛虫（Dendrolimus kikuchii），属鳞翅目（Lepidoptera）枯叶蛾科（Lasiocampidae）松毛虫属（Dendrolimus），是中国南部的重要松毛虫之一[1]，一直是我国森林保护、林业产业发展的重点防治对象[2]。思茅松毛虫主要分布在我国南方14个省[1,3-4]，危害思茅松（Pinus kesiyavar.langbianensis）、云南松（Pinus yunnanensis）、马尾松（Pinus massoniana）、油杉（Keteleeria fortunei）、华山松（Pinus armandii）等松科类植物，爆发成灾时，状如火烧，俗称“不冒烟火灾”，极大地阻碍林木生长，严重威胁森林生态景观和林产业的可持续发展[5]。另外，大面积发生时的松毛虫毒毛易使当地百姓感染“松毛虫病”[1,3,6]。经过多年研究，松毛虫害虫防治取得长足进步，但大爆发时，仍以化学农药防治为主，这些产品易对非靶标生物和环境产生负面影响[7-10]。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）对特定目标害虫有毒杀作用，但对其他动物或环境没有毒性[11]。广泛Bt菌株来源和毒素种类，为生物杀虫剂应用生产提供良好前景，也逐步成为替代化学控制农林害虫重要防控方法[12-13]。害虫幼虫取食Bt制剂后会造成其中肠组织发生系列病理变化，如棉铃虫（Helicoverpa armigera）取食含有Bt毒素饲料后，中肠组织会出现微绒毛肿胀、脱落，质膜和核膜被破坏，线粒体变形，内质网断裂等现象[14]；菜粉蝶（Pieris rapae）、舞毒蛾（Lymantria dispar）、家蚕（Bombyx mori）、烟草天蛾（Manduca sexta）等幼虫感染Bt后出现中肠细胞边缘受损坏、畸形、细胞彼此分离并从基膜上脱落等病变表现[15]。梨豆毛虫（Anticarsia gemmatalis）在感染Bt后，中肠出现微绒毛退化，呈现不规则形状的上皮细胞，细胞变性，细胞质空泡化，核染色质浓缩，出现胞质和核内含物释放到中肠管腔的细胞碎片[16]。每种杀虫蛋白可能以独特的方式影响中肠上皮细胞，因此，存在多种潜在途径导致中肠上皮细胞死亡。同样，不同昆虫对Bt敏感性也有所不同，Bt引起的中肠病变程度和类型有所差异，主要表现在中肠不同区域、不同类型的反应[17]，而思茅松毛虫幼虫在感染Bt后中肠组织病理变化研究较少。目前，昆虫组织病理多结合细胞病理及血淋巴病变开展相关研究，从各个角度加以分析综合，有助于搞清楚Bt的致病机理。昆虫血淋巴含有多种酶系，当机体遭受病原微生物、杀菌剂和杀虫剂等外源异物刺激时，发挥着免疫防御、解毒和作用靶标的作用[18-20]，如酚氧化酶（PO）在昆虫免疫反应中起关键性的作用；羧酸酯酶（CarE）主要负责正常脂类代谢和外源性脂类化合物的解毒代谢；乙酰胆碱酯酶（AChE）是有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。迄今，有关Bt对思茅松毛虫幼虫血淋巴的防御酶系和代谢酶系的影响仍不清楚。基于上述问题，本研究拟基于Probit 回归法对思茅松毛虫幼虫进行Bt室内毒力测定分析，利用组织切片法观察幼虫感染Bt后中肠组织的病理变化，通过生化方法测定在感染Bt后幼虫血淋巴的CarE、AChE、PO等酶活性，进一步探究免疫系统—中肠与血淋巴对Bt的病理反应规律，以期为今后思茅松毛虫生物防治中更好地发挥作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

思茅松毛虫采自云南省安宁市草铺镇滇油杉林（24°31′～25°6′N，102°8′～102°37′E），采集成虫在室内养虫笼里进行饲养、交配、产卵，幼虫孵化后喂食滇油杉，饲喂前的针叶用清水洗净、消毒晾干。选择个体大小一致的健康3龄幼虫（蜕皮后3 d）作为试验材料。饲养条件：温度为（27.5 ± 0.5） ℃，相对湿度75% ± 3%，光周期L∶D=16∶8[21]。供试Bt为悬浮剂（8 000 IU/μL），山东菏泽龙歌植保技术有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 Bt对思茅松毛虫幼虫的室内毒力测定

用无菌水将Bt悬浮剂进行浓度梯度稀释，分别设250 × 、500 × 、1 000 × 、2 000 × 、4 000 ×5种稀释浓度，另设无菌蒸馏水为空白对照，共6种处理，每个处理3次重复，每个重复20头幼虫。采用浸泡法[22]，将新鲜油杉分别在各稀释梯度浓度浸泡10 s后，转移至塑料养虫盒（封口盖上戳有多个透气小孔）、晾干，将3龄幼虫（饥饿处理8～12 h）转到油杉上，24、48、72 h观察和统计死亡数（用镊子轻捏其足部，完全不动视为死亡），计算死亡率和校正死亡率。通过比较分析得出毒力测定的最佳检测时间。

1.2.2 中肠组织切片的制作及观察

根据1.2.1得到毒力测定的最佳检测时间的致死中浓度（LC50）处理试验幼虫，无菌蒸馏水为空白对照，处理方法同1.2.1。分别在取食油杉6、12、24、36、48 h后，在预冷的PBS缓冲液中解剖出中肠，用4%中性多聚甲醛固定液常温固定24 h以上。然后，将中肠组织从固定液中取出，经过乙醇梯度脱水和二甲苯透明、浸蜡和包埋，用RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）切片和脱蜡脱水后，用苏木素-伊红双染色，中性树胶封片[23-24]。使用NIKONECLIPSE E100光学显微镜和NIKON DS-U3成像系统（由武汉赛维尔生物科技有限公司提供）观察并采集图像分析。

1.2.3 血淋巴3种酶活性的生化测定

血淋巴取样：试验及对照组处理和取样时段，同1.2.2。收集血淋巴时，用手将幼虫身体弯曲，使幼虫腹足暴露出来，用眼科剪剪去幼虫其中一只腹足（剪开法[25]），用移液枪吸取血淋巴转移至冻存管中，液氮速冻后-80 ℃保存。

3种酶活性测定：血淋巴在4 ℃下10 000 r/min离心10 min，上清液即为待测酶液，采用CarE检测试剂盒、AChE检测试剂盒、PO检测试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司生产）测定，操作严格按照试剂盒说明进行。具体测定方法如下：采用ELISa酶活性免疫学测定，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，标准品浓度依次为：48、24、12、6、3、0 IU/L；用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），绘制出标准曲线，通过标准曲线计算各样品中的酶活性（IU/L）。

1.3 数据统计与分析

毒力数据采用SPSS 22.0统计软件进行方差分析，差异显著采用LSD法多重比较；运用SPSS软件中的Probit回归法计算Bt悬浮剂对3龄幼虫的致死中浓度（LC50）和毒力回归方程[26]。酶活性测定数据运用GraphPad Prism 8软件（t检验）进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 Bt悬浮剂室内毒力测定与分析

不同浓度的Bt悬浮剂在不同时间内对思茅松毛虫3龄幼虫的致死情况见图1。从图1可以看出，幼虫死亡率随Bt浓度增加呈现上升趋势，各浓度对幼虫的毒性随感染时间延长均表现连续累加作用。通过对不同处理浓度Bt所致的幼虫校正死亡率进行比较分析，发现从48 h起，高浓度组幼虫校正死亡率超过50%且高浓度和低浓度之间差异显著（P＜0.05）；在高浓度组中，24～48 h的增长幅度较大，48～72 h的变化趋于缓和(图1)。此外，LC50在24～48 h的下降幅度较大，48～72 h的变化较小（表1）。由此可见不同浓度Bt悬浮剂对思茅松毛虫3龄幼虫在感毒48 h表现出最大毒性的趋势。因此，48 h是Bt悬浮剂毒力测定的最佳检测时间点。

图 1 不同时间段Bt悬浮剂对思茅松毛虫3龄幼虫的毒力Fig. 1 Toxicity of Bt suspension to the 3rd instar D. kikuchii in different time periods

表 1 不同时间段Bt悬浮剂对思茅松毛虫3龄幼虫的毒力比较Table 1 Comparison of the virulence of Bt suspensions to the 3rd instar D. kikuchii in different time periods

综上，本研究毒力测定的最佳时间点为48 h，经Probit模型计算出，48 h的Bt对思茅松毛虫3龄幼虫的LC50为13.024 IU/μL，毒力回归方程为y=0.981x-1.093，95%置信区间为9.007～21.539 IU/μL（表1）。

2.2 3龄幼虫感染Bt后的中肠组织病理变化分析

2.2.1 中肠外观病变症状

利用Bt 48 h的致死中浓度（LC50）感染3龄幼虫后，中肠外观病症见图2。从图2可以看出，正常幼虫中肠因取食松针偏绿色（图2a），病症开始于中肠前段，顶部起泡（图2b），随着感染时间的延长，病变向中肠后部推进，中肠出现肿胀并逐渐变白（图2c，d），炎症反应逐步明显，36 h白化最为典型（图2e），但48 h整个中肠直至后端，可见组织和器官变黑、腐烂，成为肠腔黑液（图2f），此时病变严重。

图 2 思茅松毛虫 3龄幼虫感染Bt后的中肠外观病症Fig. 2 Bt infection of the midgut lesion of the 3rd instar D. kikuchii

2.2.2 中肠组织病理变化

健康思茅松毛虫3龄幼虫的中肠肠壁细胞排列整齐、规则，界限清晰，围食膜明显完整（图3a）。与对照组相比，试验虫随时间的延续病变由轻度向重度发展，病变的肠壁细胞肿胀、解体，最终脱落到肠腔。各处理时间点主要表现有柱状细胞伸长变形、杯状细胞数量增多和其胞腔显著扩大，围食膜消失等情况，其中6 h，柱状细胞开始伸长变形，散乱脱落，杯状细胞数量增多和胞腔扩大（图3b）；12 h，围食膜逐渐消失、部分位置缺失，柱状细胞和杯状细胞胞腔继续伸长变形（图3c）；24 h，杯状细胞数量显著增多，柱状细胞开始脱落，围食膜完全消失（图3d）；36 h，细胞核拉长，越来越多的上皮细胞脱落（图3e）；48 h，柱状细胞、杯状细胞杯腔和细胞核极度拉长，肠壁细胞出现解体，细胞碎片脱落于肠腔，与肠腔内容物混为一体，仅剩下完整的底膜，中肠组织被严重破坏（图3f）。

图 3 3龄思茅松毛虫感染Bt的中肠病理变化（400 × ）Fig. 3 Pathological changes in the midgut of the 3rd instar D. kikuchii infected by Bt(400 × )

2.3 Bt对3龄幼虫血淋巴中3种酶活性的影响

用Bt悬浮剂48 h的致死中浓度（LC50）感染3龄幼虫后，在感染不同时间点采集血淋巴，测定了其酚氧化酶、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶的活性变化，结果见图4。图中显示，绝大多数的处理时间点（除羧酸酯酶24 h和酚氧化酶36 h外），3种酶的活性均显著高于相应对照组（P＜0.05），说明Bt对幼虫血淋巴上述3种酶有明显的诱导激活作用，尤其乙酰胆碱酯酶，在所有处理时间点与对照组比较都表现出显著差异（P＜0.05）。就感染Bt的幼虫而言，其血淋巴酚氧化酶活性，随时间推移逐渐升高，24 h达峰值，其后略有下降，48 h有所回升（图4a）；羧酸酯酶活性，随时间逐步增高，12 h达峰值，其后呈现下降趋势（图4b）；乙酰胆碱酯酶活性，24 h前变化趋势同羧酸酯酶一致，其后与酚氧化酶一致（图4c）。由此表明不同的酶受到相同外源刺激下，其酶活性变化不一致，这可能与各自酶发挥其不同生理功能有关。

图 4 3龄思茅松毛虫感染Bt不同时间的酚氧化酶（a）、羧酸酯酶（b）和乙酰胆碱酯酶（c）的酶活变化Fig. 4 The changes in enzyme activities of phenol oxidase(a), carboxylesterase(b) and acetylcholinesterase(c) in different time periods of Bt infection in the 3rd instar D.kikuchii

3 结论与讨论

Bt毒力的生物测定是Bt产品质量控制的重要指标，而毒力检测时间是生物测定中关键参数，影响毒力数据的准确性和合理性。本研究测定了不同梯度稀释Bt悬浮剂对思茅松毛虫3龄幼虫的24、48 h和72 h毒力，通过比较分析各时间点LC50变化趋势，发现感菌48 h表现出最大毒性的趋势，在后续中肠组织病理镜检中也发现48 h时的病变最为严重，由此将48 h作为Bt悬浮剂毒力测定的最佳检测时间点，其LC50为13.024 IU/μL。这与不同苏云金杆菌产品对小菜蛾（Plutella xylostella）毒力检测时间点研究结果一致，即为48 h[27]。在Bt菌株对斜纹夜蛾（Prodenia litura）幼虫的毒力测定研究发现，选用72 h作为该菌毒性测定的感染时间效果最好[28]，而苏云金杆菌对韭菜迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga）幼虫的室内毒力测定结果显示，观察时间以24 h为宜[22]。上述差异可能与研究者的关注点不同有关，即所选菌种及形式、昆虫宿主和试验设计条件等不同所致。

在苏云金杆菌对昆虫致病机理研究中，众多国内外研究者都基本关注Bt感染后的中肠组织细胞病理及体内酶活的变化，多聚焦资源昆虫或农业害虫，而关于森林害虫这方面的研究报道偏少。王程等[29]研究Bt引起的粘虫（Mythimna seperata）中肠病理变化的结果表明，杯状细胞在病变过程中由少变多，后续解体。Endo和Nighiitsuji-Uwo[30]对家蚕感染Bt的研究表明，杯状细胞胞腔明显增大。但在棉铃虫幼虫感染苏云金杆菌戈尔斯德亚种（HD-1）后中肠细胞的病理变化研究中，未发现类似症状；相反杯状细胞随病变的发展由多变少[17]。在Bt感染印度谷斑螟（Plodia interpunctella）[31]、苹浅褐卷蛾（Epiphyas postvittana）[32]、棉叶波纹夜蛾（Alabama argillacea）[33]的研究报道中，发现中肠柱状细胞和杯状细胞发生变化，再生细胞减少等现象。本研究中，Bt引起思茅松毛虫幼虫中肠病变主要表现为柱状细胞伸长、变形，杯状细胞数量增多及其胞腔显著扩大，围食膜在病变过程中逐渐模糊、直至消失，后期伴随细胞解体、脱落等严重病变情况，这与鳞翅目家蚕病理症状较为相似，与棉铃虫感染病变现象不尽相同。可见，不同昆虫对苏云金杆菌的病理反应和表现有所不同，有些甚至出现相反情况。羧酸酯酶（CarE）是昆虫体内一种主要的代谢解毒酶，能催化水解脂肪族羧酸酯、芳酸酯及相应的硫代酯等多种化合物。本研究结果表明，思茅松毛虫3龄幼虫感染Bt后血淋巴羧酸酯酶活性显著增加。这与王光峰等[19]、杨君等[20]、高希武等[34]、夏冰等[35]、钱华等[36]等研究结果基本一致，即相对于对照组，羧酸酯酶均表现为活性增强。由此表明，生物农药或化学农药对昆虫解毒酶系的影响基本相似，多为诱导激活作用；酶活性增强间接表明昆虫体内脂类物质分解活动增强，从而可能引起脂肪体的结构破坏，导致内部组织解体，加快昆虫死亡。酚氧化酶（PO）是昆虫体内黑色素合成的关键酶，PO活性通常被作为昆虫宿主的一项重要的免疫活性指标[37]，当病原体入侵时通过无活性酶原（PPO）级联被活化。研究发现，取食Bt的小菜蛾其体内的酚氧化酶上升趋势明显[38]，喂食细菌后的家蚕血淋巴酚氧化酶活性显著高于对照组[18]、大肠杆菌诱导德国小蠊（Blattella germanica）后其血淋巴抑菌活力及酚氧化酶的活性较PBS诱导组显著增加[39]。本研究表明，思茅松毛虫感染Bt后体内血淋巴酚氧化酶活性显著升高，24 h达峰值，与上述研究结果较为一致。但多杀菌素感染早期对甜菜夜蛾（Spodo petera exigua）体内酚氧化酶主要表现为诱导作用、活性增加，而在后期主要表现对该酶活性的抑制作用[19]；也有研究表明寄生性昆虫、昆虫病原细菌和真菌都能够抑制寄主昆虫体内多酚氧化酶的活性[40-41]；也有Bt杀虫剂处理角类肥蛛（Larinioides cornuta）后，虫体内PO活性与对照相比无显著变化的情况[42]。由此可见，感染不同细菌后诱发的不同昆虫体内酚氧化酶机制并不完全相同，这可能与病原物种类和宿主昆虫有关。纵观思茅松毛虫感染Bt后各时段其PO活性变化，整体呈现“升高—峰值—下降”的变化趋势。这可能由于Bt侵染开始阶段，诱导激活了PO活化途径，活性逐步升高，随着Bt大量繁殖，组织被进一步感染破坏，PO活性开始受到抑制，呈现下降趋势。羧酸酯酶（CarE）酶活力也发现类似现象，但峰值出现时间有差异；乙酰胆碱酯酶（AChE）酶活力整体趋于平缓，略有“升高—下降—上升”之势。说明思茅松毛虫幼虫被Bt感染后, 血淋巴不同酶响应和作用的时间不尽相同，相互之间协同作用共同抵御Bt的侵染。乙酰胆碱酯酶（AChE）被认为神经毒剂的靶标，杀虫剂通过抑制其活性而引起靶标害虫兴奋和痉挛，最终麻痹死亡[43]。但本研究对试虫体内AChE测定结果表明Bt对该酶不仅没有表现抑制作用，反而引起其活性显著增强。在注射嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophila）血腔毒素Tp40对大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫AChE的影响中，发现类似结果。因此，Bt对神经系统的影响是否存在其他情况，有待进一步研究。

本研究通过室内试验确定了Bt对思茅松毛虫幼虫的毒力、感染Bt后中肠组织病理反应和体内酶活的变化，结果表明Bt悬浮制剂对3龄思茅松毛虫幼虫的毒力作用、幼虫的病理反应以及致死效果都较为明显，说明市售商品化Bt制剂防治思茅松毛虫是可行的。因此，商品化Bt制剂可进一步推广到松林间松毛虫的生物防治应用中，但同时也得考虑施用条件选择，比如最适温度为24～32 ℃，晴天上午或无风的阴天，低龄期感染等，以便达到最佳防治效果。