油茶饼粕中多肽的分离纯化及抗氧化研究

杨洁茹，刘海波，李 晴，郑雪珂，朱 静

信阳农林学院 (信阳 464000)

油茶是我国重要的木本油料作物之一，它与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物。油茶饼粕是油茶籽经过榨油加工后剩下的残渣，其数量相当于茶油的3倍[1]，但是油茶饼粕大多数被用于清洁池塘和当成燃料使用，导致极大的资源浪费。油茶饼粕中蛋白质含量约为10%～15%，其氨基酸组成为17种，其中8种为人体必需氨基酸[2]，具有较高的利用价值。

蛋白质经水解后可以得到具有多种功能的活性多肽，油茶饼粕多肽具有增强免疫力、抗氧化、降血压、降血脂等功能[3]，因此可以应用于功能性食品、运动食品的研发。油茶饼粕多肽的活性和油茶品种、多肽的纯度、分子量大小等因素有关，因此油茶饼粕多肽的分离纯化及其活性仍需进一步的探索。

本研究采用胃蛋白酶对信阳地区油茶饼粕蛋白进行水解，然后进行超滤分离出不同分子量的多肽片段，再筛选出抗氧化活性最好的片段，采用葡聚糖凝胶层析法对其进行纯化。本研究对油茶加工副产物的利用具有一定的指导意义，也为对油茶饼粕多肽的分离纯化及其应用研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶饼粕为河南省信阳市油茶加工副产物；α-淀粉酶(10 000 U/mL)，上海蓝季生物；纤维素酶(≥400 U/mg)、胃蛋白酶(250 U/mg)，福州飞净生物科技有限公司。

石油醚，乙醇，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氢氧化钠，盐酸，葡聚糖凝胶G-50，三氯乙酸，茚三酮，甘氨酸，二苯基-1-苦味胼基自由基，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，30%过氧化氢，硫酸亚铁，过硫酸钾，水杨酸，抗坏血酸，维生素B2，邻苯三酚，Tris，DL-甲硫氨酸，以上试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

DZKW-0-2型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；A390型紫外可见分光光度，上海翱艺仪器有限公司；CP214型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；PHS-3C型酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；G-080ST型超声波清洗机，深圳市歌能清洗设备有限公司；DYCZ-24DN型电泳仪，北京市六一仪器厂；TG16型高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；超滤管，杭州科百特过滤器材有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1油茶饼粕粗蛋白的提取

参考李慧珍[4]等的方法对油茶饼粕进行前处理，油茶饼粕粉碎后与石油醚以1∶5的比例回流脱脂，室温风干后加入10倍体积的70%乙醇，以100 W、10 min的条件超声去除茶皂素获得脱脂脱皂的油茶饼粕。参考范东斌[5]等的方法超声辅助酶法提取蛋白，取预先处理好的脱脂脱皂油茶粕加入提前配制好的缓冲液，添加0.7%纤维素酶、50 U/g淀粉酶，50 ℃酶解120 min，然后过滤，以滤渣与70%乙醇1∶10的比例超声浸提，超声条件为时间60 min、功率360 W、温度46 ℃上下。超声浸提后再次过滤，滤液4 000 r/min离心10 min取上清液，调至pH 4.2后静置，取沉淀4 000 r/min离心10 min得到油茶饼粕粗蛋白。

1.3.2油茶饼粕粗多肽的酶法制备

参考龚吉军[6]等的方法，并稍作修改。配制2.9%的油茶粕蛋白液，并以6 950 U/g的加酶量加入胃蛋白酶进行酶解。在45 ℃、pH 2.0的条件下酶解1～4 h后，沸水浴5 min终止酶解反应，13 000 r/min离心10 min得到多肽上清液。

1.3.3超滤粗分离

参考王园园[7]等的方法。油茶粕多肽分子量在50 kDa范围内，因此选用30 kDa、10 kDa、3 kDa这3个规格的超滤管对酶解得到含有多肽分子片段的水解液进行截留分离，分离成>30 kDa、10～30 kDa、3～10 kDa和<3 kDa的4段不同分子量的水解液。对截留分离出来不同分子量的多肽进行蛋白质含量、多肽含量和抗氧化活性的测定。

1.3.4多肽纯度测定

(1)对粗蛋白、粗多肽和超滤得到的不同片段进行蛋白质含量的测定，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。

(2)多肽含量测定。参考邓湘波等[8]的方法绘制甘氨酸标准曲线，得到标准曲线回归方程y=0.036 3x+0.004，R2=0.999 3。参考杨文博[9]等的茚三酮显示法。取3 mL水解液，加入3 mL 20%的三氯乙酸溶液，静置15 min后，5 000 r/min离心10 min，取0.25 mL上清液置于25 mL容量瓶中，定容稀释100倍，取3 mL稀释液加去离子水稀释至4 mL，加茚三酮指示剂和pH 8.0的磷酸盐缓冲液各1 mL，100 ℃水浴15 min，冷却后定容至25 mL。在570 nm处测定吸光值，对照标准曲线得到多肽含量。

1.3.5多肽抗氧化活性的测定

配置浓度0.1 mg/mL的多肽溶液，进行抗氧化能力测定。

(1)DPPH自由基清除能力的测定，参照李振华等[10]的方法。

(2)ABTS自由基清除能力的测定，参照GB/T 39100—2020多肽抗氧化性测定ABTS法。

(3)羟自由基清除能力的测定，参照王层飞[11]的方法。

(4)超氧阴离子清除能力的测定，参照丁世环等[12]方法。

(5)超氧物歧化酶(SOD)活性的测定，参照苟姝贞[13]等的方法，通过SOD抑制氮蓝四唑在光下的还原作用来确定酶活性大小。

1.3.6葡聚糖凝胶过滤层析

参照魏涵伟等[14]的方法并稍作修改。取超滤分离后抗氧化活性最好的油茶饼粕多肽片段进行Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析过滤，分离范围为1.5～30 kDa。将多肽液配置成10 mg/mL的溶液，准确吸取5 mL上样，洗脱液为PBS缓冲液，流速为1 mL/min，每5 min收集1管，在280 nm紫外检测下，根据洗脱的吸光值，分别将在同一洗脱峰下的多肽液合并收集，然后对各组分进行SDS-PAGE电泳和抗氧化活性测定。

1.3.7SDS-PAGE电泳

参照吴婷婷等[15]方法并稍作修改。将1 mL的1 mg/mL样品溶液和一半的上样缓冲液混匀，上样量为20 μL，蛋白Marker加样量为10 μL。跑胶时浓缩胶的电压为80 V，分离胶的电压为120 V，条带跑至分离胶的底部停止电泳。进行考马斯亮蓝染色1 h，然后脱色直至电泳条带清晰可见。

2 结果与讨论

2.1 油茶粕粗多肽成分分析

2.1.1蛋白质含量

由表1可知，3～10 kDa的片段显著高于其它片段(p<0.05)，粗蛋白、粗多肽和>30 kDa片段的蛋白质含量较低，说明存有复合蛋白质、脂肪和碳水化合物等非蛋白质物质。粗多肽中分子量小的片段蛋白质含量更高。

2.1.2多肽含量

对酶解油茶粕粗蛋白得到的粗多肽进行超滤分离，获得分子量>30 kDa、10～30 kDa、3～10 kDa、<3 kDa的四个片段，其多肽含量见图1，经超滤浓缩后，各个不同分子量的多肽片段浓度升高，可知10～30 kDa片段多肽含量显著低于与其它片段(p<0.5)，3～10 kDa与<3 kDa无显著差异(p>0.5)。

图1 不同分子量大小片段的多肽含量

2.2 不同片段多肽的抗氧化活性分析

2.2.1DPPH自由基清除率

由图2可知，粗多肽与超滤分离的片段都具有良好的DPPH自由基清除效果，超滤过后的多肽片段对DPPH自由基的清除率显著高于粗多肽(p<0.5)，自由基清除率随着分子量的增加呈现先升高后降低的趋势，其中3～10 kDa片段的DPPH自由基清除率最高，为77.1%。总的来说，分子量小的比分子量大的对DPPH自由基清除能力强。

图2 超滤后不同分子量油茶粕多肽片段的DPPH清除率

2.2.2ABTS自由基清除率

由图3可知，超滤过后的多肽片段对ABTS自由基的清除率显著高于粗多肽(p<0.5)，ABTS自由基的清除能力与多肽分子量有一定的关联性，清除率随着分子量的降低呈现先升高后降低的趋势，其中3～10 kDa片段和<3 kDa片段的ABTS自由基清除率较高，分别为51.9%和52.8%。总的来说，分子量小的比分子量大的多肽片段对ABTS自由基清除能力强。

图3 超滤后不同分子量油茶粕多肽片段的ABTS清除率

2.2.3羟自由基清除率

羟自由基是高度氧化能力的自由基，它可以电子转移、夺取氢原子和羟基化，与氧化糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类。由图4可知，羟自由基清除率随着分子量的降低呈现先升高后降低的趋势，其中3～10 kDa片段对羟自由基的清除率显著高于其他片段，为59.2%，<3 kDa片段的羟自由基清除率下降，甚至低于粗多肽。

图4 超滤后不同分子量油茶粕多肽片段的OH-清除率

2.2.4超氧阴离子清除率

超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的重要自由基，具有较强的抗氧化能力[11]。因此在确定抗氧化活性时，清除超氧阴离子自由基往往作为重要指标。由图5可知，>30 kDa片段、10～30 kDa片段和3～10 kDa片段对超氧阴离子的清除能力均高于粗多肽，但三者之间无显著性差异(p<0.05)，10～30 kDa片段的清除率达58.5%，<3 kDa片段清除能力较弱。

图5 超滤后不同分子量油茶粕多肽片段的O2-清除率

2.2.5SOD活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)作为生物体内重要的防御系统之一，在维持机体正常生理功能中起着非常重要的作用。由图6可知多肽的SOD活性与其分子量有一定的关联性，随着分子量的降低呈现先升高后降低的趋势，其中3～10 kDa和<3 kDa片段的SOD活性较高，分别为266.1 U/(g·FW)和237.3 U/(g·FW)。

图6 超滤后不同分子量油茶粕多肽片段的SOD总活性

2.3 纯化后多肽片段的SDS-PAGE电泳结果分析

由2.2可知超滤分离得到的3～10 kDa的片段抗氧化活性最好，因此选取此片段进行葡聚糖凝胶过滤层析，得到5个组分，分别记为P1～P5，将纯化后的5个组分通过电泳进行纯度验证，并与粗多肽进行对比。如图7、图8所示，粗多肽与纯化后的P1～P5这5个组分都可见清晰的条带，粗蛋白在11～135 kDa之间，P1～P5都存在有单一的条带，且在11 kDa以下，说明Sephadex G-50纯化油茶粕多肽有较好的效果。由图8以及根据蛋白Marker的迁移率可知P1～P5的分子量在3～10 kDa，P1～P4的分子量无太大差异，P5的分子量较其它4个组分较小，与上述结果相符。

注：A为蛋白Marker；B为粗多肽。图7 粗多肽的SDS-PAGE电泳结果

注：P1～P5为葡聚糖凝胶层析纯化后的组分；A为蛋白Marker。图8 纯化多肽的SDS-PAGE电泳结果

2.4 纯化后油茶饼粕多肽的抗氧化活性

对P1～P5进行抗氧化活性的测定，由图9、图10可知，P5抗氧化活性显著高于与其它组分(p<0.5)，DPPH自由基清除率为75.6%±0.11%，OH-自由基清除率为69.1%±0.48%，ABTS自由基清除率为58.3%±0.20%，超氧阴离子清除率为62.0%±0.23%，SOD总活性为(286.2±0.15) U/(g·FW)。

图9 3～10 kDa油茶粕多肽抗氧化活性

图10 3～10 kDa油茶粕多肽SOD总活性

3 结论

本文以信阳本地的油茶饼粕作为原料，首先利用酶解法提取蛋白质，再用胃蛋白酶酶解蛋白质获得粗多肽，再筛选出抗氧化活性最好的片段，采用葡聚糖凝胶层析法对其进行纯化，并通过SDS-PAGE电泳检测纯度。主要结果如下：

酶解得到的油茶粕粗多肽中，3～10 kDa的蛋白含量显著高于其它片段(p<0.5)，为14.3%±0.15%，也证实了最终分离的片段仍然含有相当数量的蛋白质，可用于食品开发中的增值或可用于增加动物饲料配方中的蛋白质水平，与Aondona[16]研究结果一致。粗多肽的多肽含量为(4.35±0.08) μg/mL，经超滤浓缩后，各个不同分子量的多肽浓度得以提高。

对油茶粕多肽进行超滤分离，获得>30 kDa、10～30 kDa、3～10 kDa、<3 kDa 4个不同分子量大小的片段，多肽片段的DPPH、ABTS、OH-、O2-以及SOD等抗氧化活性整体上随着分子量的降低呈升高后降低的趋势，3～10 kDa的抗氧化活性最高，总的来说，分子量小的比分子量大的多肽片段抗氧化能力强，这与倪庆园[17]等人的结果一致。

采用Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析法对抗氧化活性最好的3～10 kDa片段进一步纯化，洗脱后得到五个组分，P5组分的抗氧化能力显著高于其它组分(p<0.5)，这与张紫瑶[18]小米多肽的抗氧化研究结果相符。电泳试验发现纯化后的组分有单一的条带，并在11 kDa以下，说明纯化效果较好。