骨蚀方治疗股骨头坏死的药理学机制

魏 涛，邓凯文，曾 勇，周红典，李 渔，徐祖健

西南医科大学附属中医医院 骨关节科（泸州 646000）

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是股骨头血液供应受损导致股骨头内细胞死亡，从而引起病人出现关节疼痛及活动受限等临床表现，是骨科中常见的多发性及难治性疾病[1-4]。据流行病学资料显示，在美国和日本，每年分别有2 万和1.2至2.4万例新诊ONFH病人，而在中国年龄大于15岁的人群中，累计约有812 万例ONFH 病人，其中男性发病率（1.02%）明显高于女性（0.51%），且在全世界范围内发病率呈现出逐年递增趋势[5-6]。目前，对于ONFH 病因的认识可分为创伤性和非创伤性两大类，前者主要包括股骨头/颈骨折和髋臼骨折等，后者的病因更为复杂，主要有长期吸烟和过量酗酒、不规范使用糖皮质激素、肥胖、糖尿病和自身免疫性疾病等[5,7-9]。此外，ONFH对病人生活、心理和经济造成的影响更是难以估量[10-13]。故积极探索治疗此病的新方式已成为目前研究的热点方向。

中医学依据ONFH 的临床表现，可将其归于“骨蚀”和“骨痹”等范畴，其中瘀阻络证和肝肾亏虚证又为临床常见的两种证型[14]。但由于骨蚀方药物所含成分复杂，其作用机制尚待进一步阐明。因此，本文基于网络药理学探讨骨蚀方治疗ONFH的潜在作用靶点及分子学机制，拟为骨蚀方的临床应用提供可靠的理论依据和科学基础。

1 资料与方法

1.1 骨蚀方活性成分及靶点收集

通过TCMSP 数据库收集骨蚀方中8味中药的活性成分，首先分别以“延胡索”“续断”“牛膝”“骨碎补”“独活”“川芎”“白术”和“白芍”为关键词逐一进行检索，再以口服利用度≥30%同时成药相似性≥0.18为阈值对上述药物进行再次筛选，获得骨蚀方有效活性成分信息，然后再次使用TCMSP 数据库获得活性成分所对应的靶点名称，最后使用Uniprot 数据库获得靶点对应的基因，并将物种类型选择为“human”。

1.2 股骨头坏死治疗靶点收集

首先分别通过Genecard 和OMIM 数据库以“osteonecrosis of the femoral head”为关键词进行检索，去重检索结果后获得ONFH 疾病的所有靶点，导入至Excel 对结果进行整合，然后利用R语言制作韦恩图，获得骨蚀方作用靶点并与上述靶点取交集，最后得到骨蚀方治疗ONFH的潜在靶标。

1.3 构建化合物-靶点-疾病网络

首先将治疗ONFH疾病的靶点与骨蚀方治疗靶点同时导入至Excel 合并，对结果重复值导入至新的Excel表格，此结果即为骨蚀方治疗ONFH的靶点，然后将上述结果导入至Cytoscape 3.7.2 软件获得骨蚀方与治疗靶点的互作网络图。

1.4 蛋白互作网络（PPI）构建

首先将骨蚀方治疗ONFH 的潜在靶点依次导入STRING 数据库，然后导入至Cytoscape 3.7.2 软件将结果以可视化形式展现出来。

1.5 GO生物功能与KEGG 信号通路富集分析

将骨蚀方治疗ONFH 的交集靶点利用R 语言，条件设定为P ≤0.05 进行KEGG 和GO 富集分析，并选择前20条结果绘制柱状图。

2 结果

2.1 骨蚀方化合物-ONFH靶点-疾病网络构建

通过TCMSP数据库检索骨蚀方治疗ONFH的活性成分靶标，剔除检索出的重复结果后得到：延胡索8个，续断3 个，牛膝6 个，骨碎补7 个，独活4 个，川芎5个，白术3 个，白芍4 个。其中谷甾醇为白芍、川芎、延胡索的共有成分；山奈酚为白芍、骨碎补、牛膝的共有成分；豆甾醇为骨碎补、牛膝、熟地黄、延胡索的共有成分；槲皮素为牛膝、延胡索的共有成分；β-谷甾醇为独活、骨碎补、牛膝、续断共有成分。对Genecard 和OMIM 数据库中获得的ONFH 相关基因取并集，得到ONFH 相关基因739 个。将骨蚀方候选靶标与ONFH候选靶标相比较，得到可能与治疗ONFH 的作用靶标121个，并绘制韦恩图展示（见图1）。将骨蚀方活性成分和与ONFH相关靶标同时导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建化合物-靶点-疾病网络图，图中包括158个节点。骨蚀方治疗ONFH具有多成分和多靶标等特点（见图2）。

图1 骨蚀方与ONFH靶点韦恩图Figure 1 Venn diagram of Gushi Fang and targets of ONFH

图2 骨蚀方治疗ONFH的“药物-靶点-疾病”网络图Figure 2 "Drug-Target-Disease"network diagram of ONFH treated with Gushi Fang

2.2 靶蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图

将骨蚀方治疗ONFH 作用靶点导入STRING 蛋白互作网络数据库，再将得到的靶蛋白互作图导入Cytoscape 3.7.2 软件。结果共计158 节点，515 条边（见图3）。连接度位于前30 的靶点作为骨蚀方治疗ONFH的核心靶点，其中排名前4 的包括白介素6（Interleukin 6,IL-6）、AKT1、VEGFA、MAPK3和JUN。提示这4个靶标基因是骨蚀方治疗ONFH 的重要基因（见图4）。

图3 骨蚀方治疗ONFH的PPI网络Figure 3 PPI network of ONFH treated with Gushi Fang

图4 骨蚀方治疗ONFH的核心靶点Figure 4 Core targets of ONFH treated with Gushi Fang

2.3 GO生物功能与KEGG 信号通路富集分析

GO 功能富集出生物过程总计140 条，结果取排名前20（见图5）。KEGG 信号通路富集出相关通路总计157 条，结果取排名前20（见图6）。分析结果表明，骨蚀方治疗ONFH 的靶点主要涉及细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、信号转导受体激活（signaling receptor activator activity）、IL-17信号通路（Interleukin-17 signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）以及P13K-Akt信号通路（P13K-Akt signaling pathway）等。

图5 骨蚀方治疗ONFH靶点基因GO功能富集图Figure 5 GO function enrichment map of the target genes of ONFH treated with Gushi Fang

图6 骨蚀方治疗ONFH靶点基因KEGG功能富集图Figure 6 KEGG functional enrichment map of target genes of ONFH treated with Gushi Fang

3 讨论

目前对ONFH的治疗方式主要包括手术治疗和保守治疗两类，手术治疗方式的选择又是多种多样，各有优劣，其中髓芯减压术和钽棒植入术虽然对疾病分期较早的病人疗效显著，但对于分期较晚者常常难以达到缓解临床症状的目的；而髋关节置换术虽然是治愈病人的有效方法，但作为异体结构，存在后期再次换髋和翻修的可能，加之手术风险和较高的手术费用使病人对手术治疗的接受度相对较低[15]。另外，保守治疗又分为药物治疗和物理治疗，前者主要有应用双膦酸盐抑制骨吸收，促进新骨生成，但对于此药的最佳使用浓度尚存争议；抗凝药物和血管扩张剂的应用能有效改善病灶处血液供应，预防塌陷等特点，但对于有出血风险的病人而言又限制了此类药物的使用；体外冲击波疗法和脉冲电磁疗法为治疗ONFH 常用的物理方式，主要通过促进病灶处血管生成、刺激成骨起到增加骨量等作用，而高压氧治疗可增加氧含量，改善微循环，并诱导新生血管形成，但目前相关报道较少，疗效有待大样本临床研究验证[16-17]。

中医在治疗ONFH 方面具有独特优势，对早期病人的治疗效果甚至优于手术治疗[18-19]。骨蚀方作为治疗ONFH 的特色方剂，通过长期观察发现骨蚀方在改善病人疼痛和提高关节活动度等方面疗效确切。本方重用续断和牛膝为君药，补肾强骨的同时兼顾活血通经，考虑本病病程较长，久病入络，故配伍延胡索为臣药，止痛行气之余兼活血之功，同时佐以骨碎补、独活和川芎加强诸药补肾活血之力，最后施以少量白术和白芍健脾柔肝，以上药物合用共奏补肾强骨、活血止痛之效，故“骨蚀”自愈也。此外，结合本网络药理学结果，我们推测骨蚀方通过调节IL-17、TNF 以及P13KAkt信号通路发挥治疗ONFH的作用。IL-17和TNF作为重要的促炎性因子，相比健康人群，在ONFH病人血清中含量较高，故以IL-17和TNF为治疗靶标成为目前治疗ONFH 的新思路[20-23]。亦有研究证实，通过激活P13K-Akt信号通路能促进股骨破骨细胞的重吸收，对改善股骨的骨显微参数具有积极作用[24-26]。同时，P13K-Akt信号通路在既往研究中表明，在心肌缺血再灌注中可以通过恢复细胞抗凋亡、促进肌浆网对Ca2+再摄取途径保护心肌[27]；也有研究表明P13K-Akt 信号通路可通过调控股骨血管信号通路活性，促进病灶血管修复，也可通过诱导成骨细胞增殖、抑制破骨细胞活性，从而调节二者比值，参与到治疗ONFH 疾病的过程[28-31]。

4 结论与后续验证

通过网络药理学结果得知，骨蚀方治疗ONFH 的药理学机制可能通过谷甾醇、豆甾醇、槲皮素和β-谷甾醇等成分，作用于IL-6、AKT1、VEGFA、MAPK3 和JUN 等靶点和IL-17、TNF 以及P13K-Akt 等信号通路，发挥抗炎、调节成骨/破骨细胞比值等而发挥治疗作用。后续，我们将结合本研究结果开展一系列实验验证骨蚀方治疗ONFH的具体作用机制。

（利益冲突：无）