宣白承气汤“肺肠同治”慢性阻塞性肺疾病的作用机制

孙宇洁，常永龙，郭锦晨，吴 凡，张 弯，施卫兵

安徽中医药大学：1.第一临床医学院中医内科学专业；2.新安医学教育部重点实验室；3.第一附属医院感染科（合肥 230038）

宣白承气汤组成药物为生石膏、生大黄、杏仁及瓜蒌皮，该方出自吴鞠通所著《温病条辨》一书，为吴氏所创的八个新承气汤之一。以所用药物而论，方中生大黄药性苦寒，泄热通腑、凉血解毒、逐瘀通经；石膏、瓜蒌皮性寒，清热化痰、利气宽胸；杏仁味苦而性温，功可祛痰止咳、降气平喘兼以通便润肠。四药合用，通腑化痰、清热定喘，一方之中，同时巧妙体现了“肺肠同治”、“上下同治”、“脏腑同治”的辨治思想[1]。已有现代药理学实验研究证实宣白承气汤可通过“承顺胃气”宣上通下，发挥通利大肠的作用，可改善COPD 模型大鼠肺功能、减轻肺部炎症[2]。

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以气流持续受限为典型特征的肺部疾病，气流限制过程不完全可逆，主要累及肺部，也可对肺外器官造成损害[3]。从中医学角度分析，COPD 可归于“喘病”“哮病”“肺胀”范畴。该病为肺虚不能化津，故以痰浊为早期主要病理因素，后期脏腑虚损不能运化，随之产生痰饮、瘀血等病理产物[4]。其病理变化可用本虚标实四字概括，肺病日久迁延不愈致肺脏亏虚，肺虚渐渐牵累脾肾二脏，加之病人多为老年，正气素虚，难御外邪，六淫之邪乘虚而入，痰浊、水饮、血瘀等病理因素相互影响，故病程缠绵，迁延难愈。治疗上，当标本兼顾，以宣肺化痰、降逆平喘为治疗原则，兼顾温阳利水。宣白承气汤方在清肺、肃肺同时采用通腑法，调畅肠腑气机。上下一气，腑气得通，肺气得降，咳喘等症自然得以缓解。

本研究基于网络药理学和模拟分子对接技术，旨在揭示宣白承气汤“肺肠同治”COPD的具体作用机制，以期为临床诊治COPD 提供借鉴，为宣白承气汤的进一步应用拓展思路。

1 资料与方法

1.1 药物潜在活性成分及对应作用靶点的筛选

通过检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）分别检索宣白承气汤组成药物（石膏、大黄、杏仁、瓜蒌）的化学成分，由于TCMSP 无石膏的相关数据，故选用TCMID（http://119.3.41.228：8000/tcmid/）数据库查询其化学成分。数据收集时间截至2020年9月29日，得出宣白承气汤中活性较高的化学成分，同时获取相应作用靶点。

1.2 COPD相关靶点的筛选

将“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”作为关键 词，对GeenCards 数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM 数据库（http://www.omim.org/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）五个数据库进行检索，并对上述数据库的检索结果进行整理，合并去重后作为疾病靶点数据库备用。

1.3 药物-疾病靶点网络的构建及可视化

利用Venn在线软件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将药物与疾病靶点取交集，运用Cytoscape3.7.2（http://www.cytoscape.org/）软件将宣白承气汤治疗COPD的“活性成分-交集靶点-疾病”网络进行可视化分析。

1.4 蛋白互作网络（PPI网络）的构建

将1.3 筛选得到的药物-疾病共同靶点上传至String（https：//string-db.org/）在线平台数据库进行蛋白质与蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，限定研究物种为“人”（“Homo sapiens”），设置置信度大于0.4，其余参数设置保持默认，导出PPI网络。

1.5 PPI网络聚类

应用Cytoscape 软件中的MCODE 插件将宣白承气汤与COPD 的交集靶点进行聚类分析，该插件根据拓扑结构对网络进行聚类，以寻找关系密切，可能协同发挥作用的靶点集群。

1.6 GO功能分析及KEGG通路富集分析

将宣白承气汤的有效作用靶点上传至David 6.8（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）数据库（https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8），以人类为研究对象，进行基因功能（GO，gene ontology）分析以了解靶点主要的作用过程。利用R 语言3.6.3 中的“clusterProfiler”包对关键靶点进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/）富集分析。

1.7 分子对接

从RSCB PDB 数据库中（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）获取关键靶点的3D 结构，从TCMSP 数据库中获取宣白承气汤活性成分的2D 结构，利用Chem3D软件对活性成分小分子结构逐个进行优化，使小分子结构还原为最低能量形式，更贴近对接时的状态。应用PyMOL 2.4.0 软件对关键靶点进行预处理。应用AutoDock Vina 软件进行分子对接，最后对对接结果进行三维和二维可视化分析。

2 结果

2.1 宣白承气汤活性成分的筛选

在TCMSP 数据库中检索宣白承气汤组成药物的化学成分，共计下载得到285 个化学成分，再以ADME参数中的OB 和DL 为标准进行筛选（OB ≥30%，DL ≥0.18），同时筛去无对应靶点的成分，最终共获得宣白承气汤45个潜在的有效成分，见表1。

表1 宣白承气汤潜在有效成分表Table 1 Potential effective ingredients of Xuanbai Chengqi Decoction

2.2 宣白承气汤活性成分-COPD靶点预测

将从数据库获取的数据整合，得到45种活性成分及293个靶点，通过Uniprot数据库进行标准化处理，汇总去重后得到88 个靶点。设置relevance score ≥7，由Genecards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 数据库检索整合去重后得到COPD 靶点共计7 037个，将宣白承气汤潜在活性成分与COPD 各自对应靶点取交集，得到活性成分-疾病共同靶点80 个，对应的韦恩图见图1。

图1 宣白承气汤活性成分与COPD交集靶点Venn图Figure 1 Venn diagram of intersection targets between COPD and active ingredients in Xuanbai Chengqi Decoction

2.3 “化合物-靶点-疾病”的网络构建及可视化分析

为更立体直观的显示宣白承气汤有效成分、靶点与COPD 之间的相互作用关系，利用Cytoscape 3.7.2 软件构建“有效成分-交集靶点-COPD”可视化网络图（见图2），结果显示，宣白承气汤中发挥治疗COPD作用的潜在化学成分主要有beta-sitosterol、Stigmasterol、l-SPD、estrone、Glabridin、Machiline、aloe-emodin等，主要作用于PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AB1、PGR、ESR1、ADRB2、CHRM1等靶点。

图2 “化合物-靶点-疾病”可视化网络图Figure 2 Visualization network diagram of"compound-target-disease"

2.4 宣白承气汤治疗COPD靶点的PPI网络

设置置信度大于0.4，将药物-疾病交集靶点上传至STRING在线数据库平台，导出PPI网络图（见图3）。运用Cytoscape软件中的CytoNCA插件筛选宣白承气汤治疗COPD 的关键靶蛋白，筛选过程及结果见图4，主要包 括NR3C1、MYC、CASP3、AR、JUN、ESR1、PGR、TP53等。

图3 宣白承气汤治疗COPD相关靶点的PPI网络Figure 3 PPI network of targets related to COPD treated by Xuanbai Chengqi Decoction

图4 （a-c）宣白承气汤治疗COPD的关键靶点筛选过程图Figure 4 （a-c）Screening process of key targets of Xuanbai Chengqi Decoction for the treatment of COPD

2.5 PPI网络中的关键靶点聚类

结果显示，宣白承气汤治疗COPD 的相关靶点主要可分为5 个聚类簇，可视化网络图评分从高到低见图5（A-E）。

图5 宣白承气汤治疗COPD的关键靶点聚类图Figure 5 Cluster diagram of Xuanbai Chengqi Decoction for the treatment of COPD

2.6 宣白承气汤的GO富集分析

利用DAVID 平台进行GO 功能富集分析，设定阈值P＜0.01，对筛选得到的80个关键靶点进行分析（见图6），这些靶点主要涉及了细胞对药物的反应、腺苷酸环化酶调节G 蛋白偶联受体信号通路等804 条生物过程；提示了突触后膜的组成部分、突触后膜的内在组成部分等53 条细胞组分；同时包括G 蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体的活动等71条分子功能。

图6 有效组分-基因靶点-分子功能的GO富集分析柱状图Figure 6 Histogram of GO enrichment analysis of active componentgene target-molecular function

2.7 宣白承气汤治疗COPD的KEGG通路富集分析

使用clusterprofiler R 包对80 个交集靶点进行KEGG 富集分析，以P＜0.01 为筛选标准，最终得出112 条通路富集结果。并通过微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）对富集结果的前20 位进行可视化处理（见图7）。

图7 KEGG通路富集分析对应气泡图Figure 7 Bubble chart corresponding to KEGG pathway enrichment analysis

2.8 宣白承气汤活性成分治疗COPD 分子对接结果分析

使用Cytoscape中的CytoNCA对宣白承气汤活性成分治疗COPD 分子靶点进行打分，得到网络核心靶点，Degree ≥13 的潜在靶点有8 个，分别为：TP53、ESR1、MYC、CASP3、JUN、AR、PGR、NR3C1。本研究以结合能≤-8.0kcal/mol作为筛选条件，见表2，继而对接结果进行可视化分析，见图8（A-F）。

图8 （A-F）部分靶点对接结果Figure 8 （A-F）Docking results of targets

表2 宣白承气汤活性成分与靶点的结合能Table 2 Binding energy of active ingredients and targets in Xuanbai Chengqi Decoction

3 讨论

“肺与大肠相表里”是中医基础理论中的重要理论之一，由于手太阴肺经与手阳明大肠经之间相互络属，肺的肃降功能一方面有利大肠向下排出糟粕，另一方面疏布津液下达，濡润肠壁；大肠功能传导正常，糟粕得以顺利排出，亦有助肺气的肃降以及水液的下行。目前已有组织胚胎学研究证实肺、气管与肠的结构来源相同，肺、气管组织可由原肠的前肠发展而成，由此可知肺、肠在组织上具有同源性。韩俊阁等也在试验中发现高氧状态下的大鼠模型肺与肠黏膜细胞因子在黏膜免疫方面具有同步性[5]。“肺肠同治”正是基于肺与大肠相表里的关系所提出的治疗大法，肺病兼以治肠，则糟粕下行，肺气宣通，水液布达；肠病兼以治肺，则提壶揭盖，上通下达，气机得以肃降，肠壁得以濡润，糟粕随之顺畅而出。

本研究运用网络药理学研究模式，探讨了“肺肠同治”思想理论的代表方剂宣白承气汤治疗COPD 的作用网络与潜在机制以及其中所体现的“肺肠同治”理论，根据表1、表2 及图2 研究显示，宣白承气汤主要有效化合物有45 个，其中发挥治疗COPD 作用的可能关键成分包括芦荟大黄素、原花青素、维生素E以及甘草苷。李晓红等[6]研究得出芦荟大黄素通过抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达降低对应细胞释放一氧化氮，从而发挥抗炎作用。根据现有研究，免疫系统在COPD 的发病过程中发挥着重要的作用，其中重复和进行性激活多种免疫细胞引起了慢性炎症的发病[7]。李新等[8]实验结果显示，芦荟大黄素通过调节机体内白细胞介素-2（IL-2）的水平，可显著抑制T细胞的增殖，达到调节机体免疫系统功能的效用。COPD 急性加重期时人体的氧化与抗氧化系统的动态平衡被打破，机体氧化应激水平增加，气道和肺实质炎性物质渗出增多，损伤肺组织[9]。亦有报道显示芦荟大黄素可降低便秘小鼠结肠慢波频率，同时升高小鼠结肠中胃肠活动调节物质P 物质和血管活性肠肽的含量[10]。原花青素的抗氧化活性极强，可在有效对抗自由基的同时抑制脂质过氧化[11]，从而改善COPD 病人的气道病变，减轻炎性反应。此外，原花青素对肢体缺血再灌注的大鼠肠黏膜屏障功能损伤具有保护作用[12]。维生素E在人体的抗氧化过程中扮演了重要角色，同时也是良好的自由基清除剂，在机体内可对抗氧化应激、消除炎症。维生素E作为一种抗氧化剂，可明显改善COPD大鼠的炎症反应，从而保护机体。刘江涛等[13]使用维生素E分别干预高温和PM 2.5 暴露下的COPD 大鼠，发现两组大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）含量均显著降低（P＜0.05）。甘草苷通过抑制细胞因子诱导谷胱甘肽（GSH）生物合成，具有抗氧化作用，保护肺上皮细胞免受香烟介导的氧化应激。YUAN 等[14]实验发现经甘草苷治疗的肺上皮细胞损伤小鼠肺部炎症明显减轻，提示甘草苷可能是COPD上皮细胞损伤的有效保护剂。

结合图1、2、3、4 可知，宣白承气汤对应有效作用靶点88个，COPD靶点7 037个，两者交集靶点80个，综合数据分析结果及往年文献报道，总结出其中关键作用靶点有MYC、JUN、TP53等。参与COPD气道重塑的细胞主要包括平滑肌细胞和成纤维细胞，目前已有研究表明，原癌基因（C-MYC）在成纤维细胞增殖过程中受到激活，提示C-MYC参与了COPD 气道重塑过程中成纤维细胞的分化、增殖和表型转化[15]。JUN基因的关键作用是在细胞水平上调控各种功能和过程，如增殖和信号转导。AMJAD 等[16]实验结果表明，JUN基因在吸烟的COPD 病人和正常吸烟病人中均呈显著集中高表达状态（P＜0.05），同时AP1 信号通路亚单位JUN和FOS的基因表达在吸烟的COPD病人中显著升高[17]。RONALD 等[18]研究表明，炎症基因（如NF-kB、IL-6）和TP53基因的表达呈负相关关系，可能是炎症机体在试图愈合损伤和生长新组织时，需要关闭像TP53这样的基因，这些基因会阻止损伤细胞的生长并导致细胞凋亡。PPI网络聚类显示聚类簇a评分最高，其中Caspase家族蛋白与细胞凋亡关系密切，临床试验显示敲除CASP8基因可促进非小细胞肺癌（NSCLC）病人细胞的生长和自噬，同时降低化疗敏感性和凋亡细胞死亡[19]，CASP9特有基因型是NSCLC的危险因素[20]。CCNA2和CCNB1的影响有助于有丝分裂的启动和维持[21]。同时CDK 家族蛋白和CHEK1 蛋白都是细胞周期的关键调节因子[22]。SOD1做为抗氧化系统的第一道防线，可清除细胞内产生的对生物系统有毒的自由基[23]，减轻COPD 的炎症反应。通过分子对接，发现PGR、ESR1、AR、NR3C1、TP53 与多个宣白承气汤活性成分具有较好的结合性。

GO 功能富集分析结果主要包括G 蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体的活动、儿茶酚胺绑定、突触后神经递质受体活动、类固醇激素受体活性。KEGG通路富集分析显示，这些靶点参与了PI3K-Akt 信号通路、艾巴氏病毒感染、人类巨细胞病毒感染、细胞周期等信号通路的调控。气道在受到炎症及组织损伤后，气道平滑肌表现趋于增殖修复气道的状态，发生异常的过度增殖导致气道重塑[24]。NARSA M 等[25]研究表明，PI3K/PKB 通路的激活可以促进气道平滑肌的增殖。PI3K/PKB 信号通路成为气道重塑的潜在治疗靶点，潜伏病毒感染在慢性阻塞性肺疾病的发展过程中发挥了作用，其中包括艾巴氏病毒（EBV）感染[26]。人类巨细胞病毒（CMV）作为一种血管内皮细胞的持续病毒感染，非常适合诱导促炎细胞因子，导致老年人炎症和疾病[27]。研究显示，人类巨细胞病毒感染机体时巨噬细胞相关抗原的表达加剧了机体的炎症。GUSTAVO[28]等发现抗炎和抗氧化剂可能作用于几种细胞周期调节蛋白的表达和功能，慢性炎症参与调控细胞周期关键检查点的遗传和表观遗传学改变的机制，与炎症性疾病的恶性转化密切相关。

4 结论与后续研究

本文采用网络药理学及分子对接的方法构建并分析“化合物-靶点-疾病”网络，推测宣白承气汤通过芦荟大黄素、原花青素、维生素E、甘草苷潜在药效成分协同作用于MYC、JUN、TP53 等多个靶点，通过PI3K-Akt信号通路、艾巴氏病毒感染、人类巨细胞病毒感染、细胞周期等信号通路发挥治疗COPD 的作用，初步揭示了宣白承气汤通过多成分、多靶点、多通路联合作用，共同发挥治疗COPD 作用的相关机制。为进一步探讨其发挥作用的药效物质基础和作用机制研究提供了方向，其后续尚需体内外实验进一步证实其功效网络的内在关联和作用靶点。

（利益冲突：无）