食用菌呈味肽制备及其呈味机理研究进展

林桐，赵吉春，雷小娟，雷琳，明建,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(西南大学 食品贮藏与物流研究中心，重庆，400715)

食用菌又被称作蕈，属于大型真菌，遍布于世界各地，目前全球总产量已超过700万t[1]。食用菌深受广大消费者青睐，其独特风味主要由挥发性和非挥发性成分组成，挥发性成分主导嗅觉带来香气，非挥发性成分更偏向于味觉带来的滋味和口感，而非挥发性的成分在食用菌本身的风味研究以及后续食品开发上受到更多关注[2]。呈味肽在非挥发性成分中占有一定比例，在食品风味中起着重要作用。

呈味肽是一种小分子肽，相对分子质量通常在500～1 500 Da。直接为食品提供滋味的特征滋味肽在食用菌中被广泛研究，包括甜味肽、苦味肽、鲜味肽、浓厚感肽等。研究表明，特定的氨基酸表现出特定的风味趋势，但呈味肽与其等比混合物的风味效果并不相同，这表明呈味肽的风味特征还取决于其一级结构和氨基酸序列[2-3]。呈味肽已经在多种食物中被发现，食用菌味道鲜美且肽含量丰富，但目前对于食用菌呈味肽的研究还没有得到足够的关注。因此，本文对呈味肽的分类以及食用菌呈味肽来源进行了综述，并归纳了食用菌呈味肽的呈味机理，以及制备、分离纯化、鉴定方法，以期为后期食用菌呈味肽的开发和利用提供参考。

1 呈味肽分类及食用菌呈味肽来源

1.1 呈味肽分类及结构特点

最常见的呈味肽包括甜味肽、苦味肽、鲜味肽、酸味肽和咸味肽。相比较下，前3种肽对于滋味的贡献更为直接，所以相关研究更广泛。而酸味肽和咸味肽的呈味原理有所争议，其呈味效果不能确定来自于肽本身或其携带的离子[4]。带给食用菌菌体鲜美滋味的鲜味肽是研究重点(表1)。近年来针对食用菌风味的研究出现一种叫做浓厚感肽的呈味肽，它所带来的滋味区别于上述的5种口味，浓厚感肽本身没有固有的味道，却能使食用菌的口感更加丰富[5]。

表1 食用菌呈味肽Table 1 Flaour peptides of edible mushrooms

1.1.1 甜味肽

甜味肽的甜味与其氨基酸的组成和种类密切相关。目前已知的几种甜味氨基酸分别是脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和谷氨酰胺(Gln)[11]。甜味肽的呈味效果还与其一级结构有关，尤其是氨基和羧基的定位对甜味肽的呈味效果有一定影响[12]。

1.1.2 苦味肽

影响苦味肽呈味效果最主要的原因是它的疏水性残基[13]。一些特定氨基酸，如精氨酸(Arg)、组氨酸(His)和赖氨酸(Lys)等碱性氨基酸，以及肽的疏水性可以使肽苦味加强，尤其是针对一些小分子肽[14]。大多数食用菌中的苦味肽含量不高，并不具有味觉活性，但一些有滋补和药用功能的食用菌，如灵芝等，口感略带苦涩，而这些苦涩味的来源包含苦味肽，其被认定有免疫增强的作用[15]。

1.1.3 咸味肽

咸味肽的呈味效果与其所含氨基酸种类和排序的关系并不紧密，滋味与氨基的解离程度、是否有相关离子及离子浓度有关，阳离子被认为有呈味作用，而阴离子主要是辅助功能[16]。

1.1.4 酸味肽

关于酸味肽的研究报道并不多，但大多数酸味肽都含有酸性氨基酸谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)，这说明酸味的来源与肽电离后产生的阳离子H+有关。但是单独具有酸味的肽并不多，因为酸味肽所含有的酸性氨基酸通常也具有鲜味，所以酸味肽有时被认为是鲜味肽的一部分[17]。

1.1.5 鲜味肽

鲜味肽的链长在一定程度上影响着其呈味效果，鲜味肽的氨基酸骨架的一般结构式为—O—(C)n—O—，n=3～9，当n为4～9时鲜味最强[18]。通过对肽结构和组成的分析发现，鲜味肽普遍为含有Asp和Glu的亲水性寡肽，但这2种氨基酸残基本身并不具有鲜味，而是它们的钠盐会产生鲜味，因此Asp和Glu也被归为鲜味或谷氨酸钠样氨基酸[2,19]。

1.1.6 浓厚感肽

浓厚感区别于已知的5种基本味道，是一种复杂的感觉，基本特征包括有厚度、黏稠感和持续性[20]。浓厚感肽主要可以分为3类，分别是谷氨酰肽、亮氨酸肽和其他无特异性的肽[21]。一些氨基酸的存在也被认为对浓厚感有贡献，如Asp和Gly[5]。

1.2 食用菌呈味肽来源

食用菌因其感官特性、营养价值和药用价值被视为佳肴，其中消费最多的是双孢蘑菇，其次是侧耳属菌。食用菌是新的蛋白质来源，其蛋白质含量达到19%～37%(干重)，同时也可制备各种肽，呈味肽便是其中之一[22]。不同的菌株、部位和生长阶段都对食用菌子实体中呈味肽的种类和含量有影响[23]。

大多数食用菌表现出鲜甜的口感，这与其中的鲜味肽和甜味肽有一定关系。用酶解法提取香菇、平菇、金针菇和山毛菇4种食用菌中的呈味肽，蛋白质水解产物含量无显著差异，但山毛菇能制备出更多的鲜味肽，其次是平菇和香菇，最少的是金针菇[24]。除此之外，食用菌不同部位的呈味肽含量也不相同，对于大多数食用菌来说，呈味肽在菌盖中的含量大于菌杆中[9,23]。食用菌的生长周期也影响其呈味肽的含量，不论是香菇还是大褐菇，在生长初期，菌内鲜味和甜味肽的含量都是最多的，之后会呈递减趋势。但是食用菌的子实体多数是在成熟期开始采摘，成熟后，食用菌中呈味肽含量趋于平稳[23,25]。

自身带有苦味和酸味的菌类通常被认为是有毒的而避免食用，一些药用菌尽管苦味口感明显，但仍被认为是可食用的。灵芝和云芝等药用菌所含的疏水性氨基酸比例较大，而已发现的苦味肽中常含有这些氨基酸，所以苦味肽被认为是药用菌口感苦涩的原因之一[15,26]。还有一些食用菌在酶解等加工过程中会被切割出含有苦味的肽，通常采用掩盖或选择性分离的方式脱苦，以达到品味标准[27]。

目前，关于食用菌中呈味肽的研究还处在初期，更多的研究集中在食用菌中游离氨基酸的呈味效果。同时，食用菌的滋味特征并不能完全反映食用菌中呈味肽的含量，除了呈味肽和呈味氨基酸之外，还存在其他呈味物质，如核苷酸、萜类和多糖等。所以针对食用菌呈味肽的研究应深入到其结构与滋味的表征关系。

2 制备食用菌呈味肽

食用菌因其良好的风味和丰富的蛋白质含量而受到关注，也是目前呈味肽来源研究的重点。消费者和商家主要关注食用菌的鲜味和浓厚感，所以食用菌鲜味肽和浓厚感肽的制备、分离纯化和鉴定的研究具有重要意义。制备食用菌呈味肽的一般流程如图1所示。

图1 制备食用菌呈味肽的一般流程图[5,9,28-29]Fig.1 General flowchart for the preparation of mushroom peptides[5,9,28-29]

2.1 制备食用菌呈味肽

制备食用菌中肽的方法主要有2种：制备食用菌水溶液提取物，然后直接获得内源性肽；利用外源酶的水解作用，从分离的食用菌蛋白质中释放肽片段[28]。

食用菌内源性呈味肽是食用菌生长过程中分泌出的肽[28]。在对华美牛肝菌中呈味肽提取鉴定的实验中发现，当水料比为4∶1(mL∶g)，提取温度45 ℃，4 ℃、2 000×g离心30 min，可得到溶出度最佳的呈味肽[30]。在食用菌呈味肽提取过程中，高压蒸煮是常见的预处理方式，这与食用菌食用前的烹饪操作一致，高压可以帮助菌类蛋白质释放肽, 制备出更多小于500 Da的肽组分[7]。其他预处理方式对呈味肽提取同样有效，沈健等[31]采用加热、均质、超声波和微波4种方法对香菇粉进行破壁处理，发现超声波处理后可以得到更多的鲜味肽。

酶水解具有条件温和、副产物少等优点，但由于酶具有专一性，且酶解过程中可能会产生一些不良风味，所以选择合适的蛋白酶以及反应条件十分关键。KONG等[8]对比了中性蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、食用菌蛋白酶、纤维素酶等11种酶，发现中性蛋白酶对呈味蛋白的酶解效果最佳，可以从香菇中制备出更多呈味肽。菠萝茎蛋白酶对谷氨酸和天冬氨酸有切割偏好，更适合释放鲜味肽[24]。而相较于碱性蛋白酶，酸性蛋白酶水解蛋白后，可以留下更多疏水性氨基酸残基，更适合释放苦味肽[32]。除此之外，采用纤维素酶和风味蛋白酶分步操作可以制备出更多的草菇呈味肽[7]。对于不同的食用菌，不同酶或酶的组合效果不同。因此，筛选合适的酶仍然是制备呈味肽的第一步。

2.2 分离纯化食用菌呈味肽

通常蛋白水解物纯化的第一步是采用超滤(ultra filtration， UF)技术。由于食用菌鲜味肽的分子质量通常在3 kDa以下，李晓明等[6]选取了截留分子质量为3 kDa的UF离心管，获得了所需要的白玉菇鲜味肽样本。尽管这种技术可以显著提高分离呈味肽的效率，但是很难获得高纯度的产品，因此UF处理后，产品还要进一步纯化。

食用菌呈味肽的纯化会联合凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography， GFC)和反相高效液相色谱(reerse phase-HPLC, RP-HPLC)。GFC根据所选凝胶对混合物中各分子质量不同组分的阻滞作用不同进行分离，其具有适用性广、分离速度较快的优点，但是不易分离分子质量接近的肽；而RP-HPLC基于肽混合物和固定相之间疏水性不同的分离原理，它的稳定性好、分离效率高，但受环境因素影响很大，且更适用于分子质量小的肽[33]。梁佳明等[9]和FENG等[5]都通过联合GFC和RP-HPLC技术，分别从红葱牛肝菌和双孢蘑菇中提取出纯化的呈味肽。

2.3 鉴定食用菌呈味肽

由于质谱法具有高效、灵敏和重现性好的优点，不仅可以检测出肽的分子质量，还可以确定肽的一级结构，已经被广泛用于肽序列的鉴定。质谱的原理是将多肽轰击成离子碎片，然后根据各碎片质荷比的不同进行分类和分析[33]。在对食用菌呈味肽的结构序列进行鉴定分析时，常常将液相色谱与质谱联合应用，通过结合液相质谱的分离能力和质谱的分组分离能力，根据最终肽的结构特点和所含氨基酸残基判断其所属的风味[6-7,9]。

目前食用菌呈味肽的呈味功能与其结构的关系尚不明确，所以通常在进行了质谱分析之后，还会进行感官评测，对食用菌呈味肽的具体风味进行确定，常用的2种方法是志愿者感官测评和电子舌。志愿者感官测评已经广泛应用于各类食品。FENG等[5]采用志愿者感官评测最终确定了从双孢蘑菇中制备的2种肽符合浓厚感肽的味道特性[5]。此法来鉴定食用菌呈味肽十分直接，但是大量的数据以及志愿者的不恰当描述会导致结果有所误差。电子舌是一种味道传感器，它通过化学传感器矩阵和统计数据处理来模拟人类的感知，计算出的结果更精确。在对食用菌鲜味成分的感官分析中发现，电子舌的结果与人类感觉评价的结果显著相关[29,34]。尽管如此，人体对于味道的感知受体和途径并未完全了解，电子舌也不能够完全代替人体感官评测，大多数时候还需要两者结合来对食用菌呈味肽的风味进行鉴定。

3 食用菌呈味肽呈味机理

味蕾是味觉的外围器官，由位于舌头上的柱状感觉细胞簇组成。味觉物质的分子识别发生在味蕾顶端的味觉感受器细胞，处于这里的受体赋予味觉刺激特异性，然后通过味觉神经传递，最终由大脑的味觉中枢表达[35]。哺乳动物常见的味觉感受器细胞有4种，分别是暗细胞(Type Ⅰ)、亮细胞(Type Ⅱ)、中间细胞(Type Ⅲ)和基细胞(Type I)，不同的细胞有不同的功能。暗细胞的占比最大，它与蛋白质和酶的转运有一定关系；亮细胞是最主要的味觉识别传导的细胞，它可以表达G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)，包含2种味觉受体，即1型味觉受体(type 1 receptor,T1R)和2型味觉受体(type 2 receptor,T2R)；中间细胞具有超微结构可识别的突触；基细胞属于增殖干细胞，可以分化出其他味觉细胞[36]。

如表2所示，食用菌呈味肽的呈味机理除了与受体特异性结合有关之外，还与氨基酸解离程度以及所含特殊阳离子、阴离子有关，且不同类型的呈味肽的呈味机理也有所不同。

表2 不同呈味肽的特征及其所对应的受体Table 2 Receptors and characteristics of different flaour peptides

甜味肽的受体被定义为C类GPCR，以T1R2和T1R3亚基的异源二聚体形式存在。根据夏伦贝尔的AH/B生甜学说，甜味肽的分子结构中有一个能形成氢键的基团—AH(如—NH2)和一个电负性的基团—B(如—COOH)，—B与—AH之间的距离大约在0.23～0.4 nm。同时甜味受体T1R2+T1R3也有一个类似的AH-B结构单元。甜味肽的AH-B结构单元与受体的AH-B结构单元结合后，会刺激味觉神经，从而产生甜的感觉[12]。除此之外，甜味肽的呈味效果还与所带电荷和亲疏水基团有关。当去除带负电荷的残基后，甜味会提高；反之去除带正电荷的残基后，甜味会下降。这可能是因为甜味受体上存在着带负电荷的基团，可以与肽的正电荷侧链形成盐桥[37]。同时，疏水基团会因为掩盖了受体的结合位点而使甜味下降[38]。

目前已知的苦味肽受体T2R有25种以上[39]。苦味肽的疏水性对苦味的呈现十分关键，它的疏水性主要由肽链中的氨基酸种类和序列决定，其中疏水氨基酸可以有效增强肽的疏水性来影响肽与受体的结合[40]。苦味肽被认为像“钩子”一样附着在T2R受体上，从而将分子的疏水部分带入受体细胞表面的网状结合位点，之后形成受体-配体复合物来表达苦味[46-47]。药用食用菌的苦味很明显，除了一切常见的苦味物质外(如萜类)，疏水氨基酸的占比也很高，尤其是云芝，苦味氨基酸的含量高达8.42 mg/g(干重)[26]。

T1R1+T1R3异源二聚体是最早被认定的鲜味为受体，之后发现味蕾上还有2个亲代谢型Glu受体mGluR4和mGluR1[36]。当鲜味肽具有带负电、带正电和疏水性的基团，且被鲜味受体N末端的捕蝇草结构域(enus flytrap domain,FTD)识别，才能呈现出鲜味[41-42,48]。红葱牛肝菌中提取的鲜味肽Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-Glu-Glu-Asn-Phe-Lys，前2个氨基酸残基(Phe-Lys)可以看作带正电荷的基团；中间5个氨基酸残基(Asp-Leu-Gly-Glu-Glu)可以看作带负电荷的基团；而末端3个氨基酸(Asn-Phe-Lys)可以看作弱疏水性的基团，其结构符合鲜味肽的特征[9]。

咸味肽呈味的关键是其电离出的阳离子，因为阳离子易吸附到细胞膜上的磷酸基上，随后阳离子会经过细胞膜上的钠离子通道(epithelial Na+channel ENaC)，继而使Ca2+富集，细胞去极化，最后释放信号传递至大脑使之产生咸味感觉。但要解释人体对咸味的敏感性，还存在如瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential anilloid 1,TRP1)的通道[49-50,43]。

中间细胞可以识别酸味肽，而离子通道是酸味的传递者，其中瞬时受体电位阳离子通道(transient receptor potential cation channel, TRP)超家族的多囊肾病样PKD1L3和PKD2L1是酸味肽的重要传感器[44]。H+是一个重要的酸味信号传导工具，所以酸味肽主要依靠酸性氨基酸残基电离出的H+渗透到中间细胞，然后通过信号传导，最终产生酸味[36]。

目前被认为是浓厚感肽受体的钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)存在于舌后部[45]。CaSR的激活剂主要是一些亲水性的物质，由浓厚感肽激活CaSR的研究主要集中在γ-谷氨酰肽上。γ-谷氨酰肽与CaSR的胞外FTD结合，导致细胞去极化，释放的ATP通过刺激味觉传入神经上的ATP受体产生浓厚感的信号[20,44]。但CaSR似乎还与T2R共表达，且对鲜味也有一定潜在识别作用，所以CaSR是否对浓厚感的识别具有专一性还需进一步研究[21]。味觉受体示意图如图2所示。

图2 味觉受体示意图[20,36,43-44]Fig.2 Schematic diagram of taste receptors[20,36,43-44] 注：PLC-磷脂酶；IP3-三磷酸；cAMP-环磷酸腺苷

4 结论

呈味肽包括甜味肽、鲜味肽、苦味肽、咸味肽、酸味肽和浓厚感肽。它们的呈味效果与其所含的特定氨基酸残基、亲疏水性和阴阳离子有关，但具体定性定量的关系还未明晰，仍然在发掘阶段。对于呈味肽呈味的机制，目前已经找到基础的受体，但环境对呈味肽呈味效果的影响以及受体与呈味肽特殊结构之间的识别方式尚未研究，导致不少呈味肽的结构与其呈味机理并不完全相符。

食用菌富含高质量的蛋白质，且多数味道鲜美，是呈味肽的来源之一。目前，针对食用菌的呈味肽研究仅集中在鲜味肽，对于其他呈味肽的研究甚少，且缺少不同种类食用菌之间呈味肽含量和种类的对比，以及各种食用菌呈味肽提取方法之间的比较。食用菌呈味肽可能成为今后的热点，还应该进行更深入的研究。