冷吃牛肉特征风味物质

万晓玉，向昱州，周莺茹，刘梓建，林洪斌，袁先铃*

1(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾，644000)2(自贡市谭八爷食品厂，四川 自贡，643000) 3(西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都，610039)

冷吃牛肉是自贡特色小吃，迄今已有百余年加工历史，是自贡饮食文化的重要载体。它是一种经过常温腌制和卤制脱水定型，以植物油为加热介质，加入调味品和香辛料炒制而成的熟肉类食品，冷却后食用口感更佳。与其他牛肉制品不同的是，自贡冷吃牛肉经过炒制的特殊工序，具有良好的风味和外观，口感酥软；炒制后浸泡在油中，保存时间长，风味也更加浓郁。由于深受消费者喜爱，生产冷吃牛肉的企业也在增多，据不完全统计，这些企业的冷吃牛肉产品仅互联网年销售产值就高达近1亿元。风味是影响消费者选择的重要因素，因此产品风味物质的稳定至关重要，明确风味物质组成及特征对冷吃牛肉产品标准化具有重要意义。

近年来，国内学者针对酱卤牛肉的研究较多，李素等[1]研究了卤牛肉及肉汤在贮藏期间挥发性风味物质的变化，并采用香气活力值分析结合主成分分析得到其主要风味贡献物质；李娟等[2]发现醛类、醇类、醚类是北京地区老字号酱卤牛肉中主要的挥发性风味物质，对酱卤牛肉整体香气起主导作用。国外学者对牛肉原料及牛排的研究较多，ARSHAD等[3]研究发现反刍动物主要挥发性风味物质由美拉德反应、脂质氧化、维生素降解产生；GARDNER等[4]发现牛排质量等级和成熟度对挥发性风味物质的种类和含量有较显著影响。冷吃牛肉作为盐帮菜的代表，目前的研究主要集中在开发新型冷吃牛肉，对冷吃牛肉的特征风味物质进行解析的报道较少。本实验采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪(headspace-solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)分离鉴定冷吃牛肉挥发性风味物质，结合各成分的风味活度值，通过主成分分析解析自贡特色冷吃牛肉的风味物质构成及特征，为其标准化生产及风味调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

冷吃牛肉样品采样完成后置于冰盒当天运回实验室进行分样，每份样品不少于1 kg。每个品牌采集3个平行样品，然后充分混合均匀，准确称取样品分装于若干个无菌取样管，以上过程均在超净工作台内完成，分装后储存于冰箱内。N1冷吃牛肉，自贡市捌零盐帮食品有限公司；N2冷吃牛肉，自贡市谭八爷食品厂；N3冷吃牛肉，自贡市国名食品有限公司；N4冷吃牛肉,自制；2-乙基丁酸标准品99%，麦克林药品公司。样品具体信息如表1所示。

Supelco 65 μm PDMS/DB 固相微萃取头，美国Supelco公司；TSQ8000型气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX -UI石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美国Thermo Fisher公司；分析天平，华志科技有限公司；HH-1型数显恒温水浴锅，上海至翔科教仪器厂。

表1 样品信息Table 1 Sample information

1.2 实验方法

1.2.1 自制冷吃牛肉前处理方法

将新鲜牛肉切丝，长5 cm，宽、厚均为1 cm，经清水漂洗去血水后，加调味料进行腌制，经卤煮、炒制、然后每包产品100 g真空包装，取样后放置在4 ℃的冰箱备用。

1.2.2 风味组分检测方法

萃取条件：萃取头在250 ℃老化0.5 h，称取4.000 g样品置于20 mL顶空瓶中，添加10 μL的0.41 mg/mL 2-乙基丁酸作为内标物，在60 ℃恒温条件下吸附30 min，萃取结束后在GC进样口250 ℃解吸5 min[5]。

GC条件：色谱柱采用Thermo Fisher DB-WAX-UI石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升温程序为先40 ℃保持3 min，再以5 ℃/min升至90 ℃，保持10 min；再以3 ℃/min上升到150 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

载气(He)流速0.8 mL/min，不分流。2次进样均以250 ℃老化20 min，去除色谱柱中残留杂质。

MS条件：电子电离源；电子能量70 e；离子源温度200 ℃；溶剂延迟时间5 min；全扫描模式；质量扫描范围m/z35～500。

1.2.3 风味组分定性和定量分析

样品中的挥发性成分经气相色谱分离后，用质谱仪进行分析鉴定。结果通过计算机谱库NIST11进行定性分析，选择匹配度>800(总值1 000)的检索结果。以2-乙基丁酸作为内标进行定量分析，根据公式(1)计算各物质的绝对含量。

(1)

式中：ωi，各风味物质的绝对含量，μg/kg；Si，各物质的峰面积；S标，内标物的峰面积；mi，样品质量，kg；m标，内标物质量，μg，本实验内标物的质量为4.1 μg。

1.2.4 气味活度值(odor actiity alue,OA)分析

OA是风味物质的质量浓度与其阈值的比值，按公式(2)计算。

(2)

式中：ωi,测定挥发性化合物的含量，μg/kg；Ti,相同物质在水介质的嗅觉阈值，μg/kg。

1.2.5 感官分析

选择与食品专业相关的人员10人组成评定小组，以冷吃牛肉的脂肪味、茴香味、花香味、柑橘味为评定指标，评分标准如表2所示，结果取平均值。

表2 冷吃牛肉感官分析风味评分标准Table 2 Sensory score criteria of cold eating beef

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0统计分析软件进行主成分分析，Excel和Origin进行图表绘制，SIMCA进行PLSR分析。

2 结果与分析

2.1 各种冷吃牛肉挥发物分析

由图1～2与表3可知，4种自贡特色冷吃牛肉中共检测出54种挥发物。其中N3中检测出39种风味物质，N2中检测出37种风味物质，N1检测出30种风味物质，N4中检测出33种风味物质。总含量分别为3 968.12、3 403.31、3 171.4、3 105.57 μg/kg。这些香气化合物主要包括烃类、醇类、酸类、醛类、酯类、酚类以及醚类。冷吃牛肉挥发性成分相对含量最高的为醇类，其次为烃类、醛类、酸类，含量最少的为酯类。

图1 冷吃牛肉挥发物含量Fig.1 olatile flaor components in cold eating beef

表3 冷吃牛肉挥发物分析Table 3 Analysis of flaor substance in cold eating beef

图2 冷吃牛肉挥发物种类Fig.2 olatile flaor arieties in cold eating beef

烃类化合物主要来源于脂肪酸烷氧自由基的均裂[6]，实验共检测出11种烃类，分别占N1挥发物总含量的11.86%、N2的14.53%、N3的14.52%、N4的15.75%。长链烷烃(如正十四烷、十五烷、十六烷等)来自脂肪酸的降解或动物的饲料沉积在动物体内的脂肪[7]，短链的烷烃是脂肪自动氧化的次级产物，烯烃类物质则大多来自于香辛料。实验检测到的烯烃类物质有4-萜烯、β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯等，含量较高，但烷烃类化合物的阈值高，对牛肉风味的贡献较小。

醇类化合物主要来自脂肪氧化或香辛料，也可能是由醛类还原所得[8]，是清香类物质的代表。直链饱和醇的风味阈值较高，对冷吃牛肉整体风味贡献较小，不饱和醇的风味阈值较低，对风味贡献较大，如1-辛烯-3-醇阈值为1，能赋予产品蘑菇香气。芳樟醇阈值为6，能赋予产品花香和薰衣草味。香叶醇阈值为6.6，能赋予产品玫瑰、天竺葵味。实验检测出的醇类物质共10种，分别占N1总挥发物含量的53.95%、N2的44.56%、N3的35.17%、N4的43.81%，而醇类化合物中占比最高的化合物为芳樟醇。松油醇、芳樟醇、肉桂醇存在于肉桂挥发性成分中，是牛肉制品香气的主要贡献者[9]；香叶醇、孜然醇来自香辛料[10]，对牛肉风味贡献很小，但对整体风味有协同效应。

酸类和酯类在冷吃牛肉中虽然被检测出，其挥发性较小，阈值较高，仅对整体风味有微弱的调节作用，但有一些化合物是形成杂环化合物的重要中间体，因此对形成肉香具有不可忽视的基底作用[11]。本实验检测出6种酯类、10种酸类，酯类物质来源于冷吃牛肉中醇类和羧酸类化合物之间的酯化反应，加工中料酒的加入对酯类物质的形成可能有一定贡献。

醛类化合物主要源于不饱和脂肪的氧化和蛋白质的降解，具有鲜香味，有较低的阈值，相对含量较高的小分子醛对牛肉风味贡献较大，尤其是Strecker降解产生的带支链的醛类，主要构成肉香味[12]。实验共检测出8种醛类物质，分别占N1总挥发物含量的1.87%、N2的5.51%、N3的4.57%、N4的3.8%，主要为苯甲醛、反式-2,4-癸二烯醛、P-茴香醛和肉桂醛。直链脂肪醛如壬醛主要来源于花生四烯酸的氧化分解，具有果香、脂肪香味[13]；苯甲醛是苯丙氨酸的降解产物，具有苦杏味；反,反-2,4-癸二烯醛具有淡脂香味[14]，阈值较低，对冷吃牛肉风味贡献较大。这些物质赋予冷吃牛肉清香味，对整体风味起修饰作用。

酚类化合物大多来自加入的香辛料，实验共检测出4种酚类，分别占N1总挥发物含量的7.7%、N2的6.19%、N3的6.85%、N4的3.93%。乙基麦芽酚有极浓醇的焦糖香味，能和肉中的氨基酸起作用，明显提高肉香鲜味。

醚类化合物主要来自香辛料，具有强烈而愉快的香气。本实验只检测出3种醚类物质：草蒿脑、茴香脑和苦艾脑，分别占N1总挥发物含量的16.23%、N2的15.77%、N3的19.13%、N4的16.71%。茴香脑的占比相对较高，呈鲜茴香汁味，可能与牛肉煮制过程中加入的大茴、八角等茴香类辛香料有关[15]，在提供呈香、呈味的同时，还增加牛肉的醇厚感。草蒿脑呈类似甘草、茴芹的味道，在卤牛肉中也经常被检测到，可赋予产品愉悦的香气[16]，在牛肉样品中含量较高，可能源于八角、茴香、小茴香等香辛料。

2.2 挥发物OA分析

根据所选取阈值计算OA>1的挥发性风味物质，OA越大，则该物质对风味的贡献越大。由表4与图2可知，从N1、N2、N3、N4中分别检测出10、13、12、10种风味贡献较大的物质，醛类、烃类、醇类物质较多。整体来看，4种冷吃牛肉芳樟醇OA均为最高(195.19～235.31)，其次是反,反-2,4-癸二烯醛(34.36～61.88)、1-辛烯-3-醇(7.43～56.44)、茴香脑(27.98～48.23)、4-乙烯基愈创木酚(6.05～20.24)、β-蒎烯(12.96～15.59)、香叶醇(2～13.2)。

N1中OA>10的风味物质有芳樟醇、反,反-2,4-癸二烯醛、茴香脑、4-乙烯基愈创木酚、β-蒎烯、香叶醇。芳樟醇是一种单萜类醇，是许多植物精油的主要挥发性成分，具有花香和薰衣草味[2]，被认为是肉类风味中最重要的香气活性物质。反,反-2,4-癸二烯醛是加热食用油和油炸食品中的主要挥发性成分，具有脂肪味和烤肉味[17]。4-乙烯基愈创木酚具有肉香味和甜香味，β-蒎烯具有松香味，香叶醇具有玫瑰和天竺葵味[1]。N1的风味特征可概括为花香味、脂肪香味和茴香味。

表4 冷吃牛肉OA及其风味描述Table 4 OA of flaor substances of cold eating beef and their flaor description

N2中OA>10的风味物质有芳樟醇、1-辛烯-3-醇、反,反-2,4-癸二烯醛、茴香脑、4-乙烯基愈创木酚、β-蒎烯。其中1-辛烯-3-醇能赋予冷吃牛肉蘑菇香气。N2的风味特征可概括为花香味、蘑菇味、脂肪香味和松香味。

与N2相比，N3中的特征风味物质种类和含量相差不大，因此风味特征也相似。N4中OA>10的风味物质有芳樟醇、茴香脑、β-蒎烯，风味特征为花香味、茴香味和松香味。

不同冷吃牛肉的风味特征有所差异，总体概括冷吃牛肉的风味特征为：花香味、蘑菇味、脂肪味、茴香味和松香味等，其中花香味、脂肪味、蘑菇味、茴香味较明显。

2.3 挥发物主成分分析

主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和贡献方向[18]如图3所示，其贡献率数据见表5。在主成分1中，香叶醇、茴香脑、芳樟醇、反，反-2，4-癸二烯醛和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚有较高的正载荷，肉桂酸乙酯、β-蒎烯有较高的负载荷，说明主成分1反映的主要为这5种风味物质的综合信息；在主成分2中，十六醛、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚、1-辛烯-3醇、对乙烯基愈创木酚、芳樟醇有较高载荷，说明主成分2主要受这5种风味物质影响；主成分3上草蒿脑、反,反-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、柠檬烯有较高的正载荷。

图3 冷吃牛肉主成分分析载荷图Fig.3 Principal component analysis loading plot of cold eating beef

挥发性化合物主成分1贡献率主成分2贡献率主成分3贡献率X1香叶醇0.950-0.048-0.309X2柠檬烯0.898-0.2590.356X3芳樟醇0.8930.174-0.415X4反,反-2,4-癸二烯醛0.8760.2870.387X5肉桂酸乙酯-0.840.3870.381X6β-蒎烯-0.8310.5560.026X7P-茴香醛-0.730.495-0.47X8壬醛0.702-0.408-0.583X9D-柠檬烯-0.553-0.8170.164X10茴香脑0.2690.8020.533X11十六醛-0.120.762-0.636X124-乙烯基-2-甲氧基-苯酚0.689-0.719-0.093X134-乙烯基愈创木酚0.280.690.668X141-辛烯-3-醇-0.168-0.3980.902X15草蒿脑-0.4210.2460.873

冷吃牛肉的关键风味物质主要为反,反-2,4-癸二烯醛、P-茴香醛、十六醛、肉桂酸乙酯、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、茴香脑、草蒿脑、β-蒎烯、柠檬烯、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚以及对乙烯基愈创木酚。醛类化合物具有脂肪、黄油和绿植等香味，其中反,反-2,4-癸二烯醛是一种具有强烈油炸味的芳香物质，可进一步氧化降解生成短链醛，壬醛是牛肉的特有的风味物质，主要来自脂肪氧化。而香叶醇、芳樟醇与冷吃牛肉制备过程中添加的香辛料有关[19]，芳樟醇具有花香和薰衣草香味，被认为是肉类风味中最重要的香气活性物质；香叶醇具有玫瑰香气，广泛用于食物香精。醚类化合物中茴香脑主要呈茴香、辛香和甘草香，被认为是酱香的主要来源和酱牛肉的重要特征香味[16]；草蒿脑呈甘草、茴芹味，可赋予产品愉悦的香气，可能源于八角、茴香等香辛料[20]。酚类化合物中2-甲氧基-4-乙烯基苯酚是美拉德反应的产物，具有辛香、丁香香气和甜香味[21]；4-乙烯基愈创木酚主要来源于酱油，呈发酵香气[22]，略带甜味，有缓和咸味的作用。这些挥发性风味物质共同组成了冷吃牛肉的特征香味，通过调整香辛料配比和加工工艺可以改善冷吃牛肉整体风味。

对冷吃牛肉15种重要香气成分进行主成分分析。3个主成分贡献率达100%，可用这3个主成分代替上述15种重要香气成分物质对不同品牌的冷吃牛肉进行分析。根据各主成分的特征向量与标准化后的指标计算各主成分的得分(Y1～Y3)，以各主成分对应的解释贡献率为权重,可构建综合评价模型为：Y=47.5Y1+28.5Y2+23.95Y3，根据模型计算出不同冷吃牛肉的综合总得分。从表6可知，N2冷吃牛肉的得分最高，其冷吃牛肉风味最佳。

表6 冷吃牛肉主成分分析得分Table 6 The PCA score of cold-eating beef

2.4 不同冷吃牛肉样品感官风味评定分析与挥发物的相关性分析

由表7可知，N1脂肪味和茴香味较丰富，N2的茴香味和脂肪味较浓郁，而N3和N4的较差，可能是添加的调味料和加工工艺不同。从总分来看，N1(29分)>N2(28.3分)>N3(26.6分)>N4(23.2分)，相对于品牌冷吃牛肉来说，自制的冷吃牛肉相当于家庭式制作，口感较为普通，总体均具有冷吃牛肉特有的风味。

表7 不同冷吃牛肉样品感官风味评定结果Table 7 Sensory ealuation results of cold eating beef samples

以4个冷吃牛肉样品中出现的54种挥发物为X变量，感官评定得到的冷吃牛肉风味特征值为Y变量进行PLSR分析，结果见图4。第一象限与第三象限不包含风味特征指标，分析这2个象限中的风味物质，脱氢乙酸、十四酸、己酸、十八烯酸、苯甲醛等物质不具有明显风味特征；D-柠檬烯具有柑橘、薄荷味，苯乙醇具有玫瑰香气，β-蒎烯具有松香香气，与感官品评辨别的风味有所不同，姜黄烯、异丁香烯、4-萜烯、α-松油醇、肉桂醛、松油醇cis-β-、2-甲氧基-4-乙烯基愈创木酚阈值较大[2]，对风味具有协同效应。花香和脂肪香位于第二象限，茴香、蘑菇香风味特征位于第四象限，相对距离较近。反,反-2,4-癸二烯醛、P-茴香醛、肉桂酸乙酯、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、茴香脑、柠檬烯、香叶醇、壬醛、孜然醇、3-蒈烯、对乙烯基愈创木酚都位于第三和第四象限，且距离风味特征很近，说明这些化合物对冷吃牛肉风味特征有较大的贡献，这与主成分分析结果大致相同。

X-挥发物；Y-感官属性图4 香气成分与感官属性的PLSR图Fig.4 PLSR plot of aroma components and sensory attributes

3 结论

分析冷吃牛肉共得到54种挥发物，醇类物质含量最高，主要来源于香辛料；醛类物质10种，主要源于脂肪氧化，其次为烃类、酸类、酚类、醚类、酯类和其他。16种气味活性化合物(OA≥1)中占比最高的是醇类物质(66.15%～73.29%)，然后是醛类(10.09%～16.84%)，其他各类物质占比较少。经主成分分析，得出风味贡献率较高的物质有反,反-2,4-癸二烯醛、P-茴香醛、肉桂酸乙酯、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、茴香脑、草蒿脑、β-蒎烯、柠檬烯、对乙烯基愈创木酚。通过PLSR分析发现，反,反-2,4-癸二烯醛、P-茴香醛、肉桂酸乙酯、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、茴香脑、柠檬烯、香叶醇、壬醛、孜然醇、3-蒈烯、对乙烯基愈创木酚等化合物与冷吃牛肉的脂肪香、花香、茴香和蘑菇香等风味特征相关，与主成分分析结果大致相同。