CBX3 在脑胶质瘤中的表达分析及其对胶质瘤细胞凋亡的抑制作用

李炽阳，杨帆，杨悦，陆云涛，周强

南方医科大学南方医院神经外科，广州 510000

胶质母细胞瘤是成人最常见的原发性恶性脑肿瘤，其5年生存率不足10%。目前胶质母细胞瘤的治疗仍以外科手术为主，术后放疗、化疗、同步和辅助替莫唑胺（TMZ）、电场治疗（TTFs）等为辅，外科手术是脑胶质瘤整个治疗过程的基石[1～3]。

异染色质蛋白1（HP1）是异染色质的主要成分，由三种同源物组成：CBX1，CBX3 和CBX5。CBX3（染色框同源物3 重组蛋白）可以识别并结合组蛋白H3 赖氨酸9（H3K9）以招募许多功能辅助因子以完成多种细胞生物过程[4]。此外，CBX3 在许多癌症中表达异常失调，包括结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌、舌癌和肺癌等，其在癌症进展的表观遗传调控中发挥了重要作用[5,6]。已有研究表明CBX3 可促进胶质瘤细胞系U87MG 细胞增殖并预测不利的预后[7]。然而CBX3 在胶质瘤标本中的表达情况其与胶质母细胞瘤患者生存预后的关系尚不明确。另外CBX3 已被证明可以显著抑制血管平滑肌瘤、食管鳞状细胞癌以及肝细胞癌的凋亡[8]，但其对胶质母细胞瘤细胞的凋亡水平是否产生影响尚未知。

因此本研究通过对TCGA 和CGGA 数据库中胶质瘤患者CBX3 的表达情况进行分析，明确其表达水平与患者预后之间的关系，并通过细胞功能实验进一步研究CBX3 对胶质瘤细胞凋亡水平的影响。

1 资料与方法

1.1 TCGA 数据库提取数据

利用R 包“cgdsr”获取TCGA 数据库(https://www.cbioportal.org/）中LGG 及GBM 患者的转录组数据，并进一步利用R 语言分析CBX3 在LGG 及GBM 患者中的表达差异。筛选条件如下：筛选条件如下: ①“Cancer Type：Brain and CNS Cancer”；②“Gene:COL1A2”；③“Data Type: all”；④“Sample Type:Clinical Specimen”；⑤“Analysis Type: Cancer vs.Normal Analysis”；⑥临界值条件P value＜0.0001，FC（fold change）＞2，gene rank=top 10%.

1.2 利用CGGA 数据库分析CBX3 在胶质瘤中的表达及预后

CGGA 数据库是癌症基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，可用于挖掘癌症基因信息。选择中国脑胶质瘤基因组图谱(chinese glioma genome atlas，CGGA)的mRNAseq_325 数据库，分析CBX3 在GBM不同WHO 分型患者间表达差异，并探讨CBX3 与胶质瘤患者预后的关系。

1.3 CBX3 相关基因富集分析

首先使用STRING 数据库(https://string-db.org/)筛选了50 个有实验验证的与CBX3 结合的蛋白，再利用GEPIA 进行相关性分析，并选取与CBX3 相关性前100 的基因。为了分析CBX3 相关基因的生物学功能和信号通路，将这150 个基因取并集，用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）进行KEGG 富集分析，利用R 语言“ggplot2”包进行可视化。此外，还应用“clusterProfiler”包进行了GO 富集分析。

1.4 细胞培养和转染

购买美国ATCC 公司的U87、T98 细胞系。用10%胎牛血清（FBS、HyClone、Loga）在DMEM 培养基中培养在37 ℃，5%的CO2孵箱中。转染si 小干扰片段和过表达质粒使用Lipofectamine2000 和血清培养基Opti-MEM 混合后制成浓度为10 nm 的溶液转染到细胞中，48 h 后使用QPCR 和蛋白免疫印迹法检测敲减和过表达效率。

1.5 RNA 制备与实时定量RT-PCR

Trizol（Invitrogen，Wal tham，MA，USA）从细胞中提取总RNA。用PrimeScriptTM RT 试剂盒（Takara 生物技术，大连，中国）反转录RNA）进行cDNA 合成和基因组DNA 去除。在Takara 实时PCR 系统中使用SYBR 预混物ExTaqTM II 试剂盒（Takara）进行定量实时PCR。以基因GAPDH 作为内源性控制。将目的基因的每个mRNA 的相对表达归一化作为内源性参照，并采用2-ΔΔCq 法分析。cDNA 合成和去除基因组DNA 以及扩增程序按照试剂盒使用书进行。

CBX3,β-actin 引物如下：CBX3:5'-AGAGATGCT GCTGACAAACCAAGAG-3' (forward) 和5'-GCACCA AGTCTGCCTCATCTGAATC-3' (reverse)；β-catenin:5'-TGCAGTTCGCCTTCACTATGG ACT-3'(forward) 和5'-GATTTGCGGGACAAAGGGCA AGAT 3' (reverse)。

1.6 免疫印迹分析

在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液中溶解细胞收集蛋白质，然后用10%或8%的SDS-PAGE 凝胶上分离总蛋白，用PVDF 膜转移蛋白印迹，膜在4 ℃与下列抗体孵育过夜：Rat anti-CBX3(1:1,000;cat.no.#2619)，anti-GAPDH (1:3,000;cat.no.ab8245)，随后，辣根过氧化物酶结合的二级山羊抗兔IgG 抗体(1:5000；cat，no.b6721,Abcam)在室温下与膜一起孵育2 h。根据制造商的方案，使用ECL试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc .)对膜进行可视化。使用Image Studio 软件(版本4.0；LI-COR 生物科学)。GAPDH 用作阴性对照。

1.7 流式细胞术细胞凋亡检测

将已证明转染有效的细胞系培养在添加10%FBS DMEM 培养基中。随后，收集细胞并用碘化丙啶（PI）和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（FITC）染色以进行凋亡分析。凋亡细胞的百分比分别计算为位于右下象限和右上象限的早期和晚期凋亡细胞的总和[9]。

1.8 统计学分析

CBX3 在不同类型组织中表达量差异采用t检验进行统计学分析。CBX3 表达与胶质瘤预后的关系采用SPSS 进行统计学分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CBX3 在胶质瘤中的表达情况

我们首先对TCGA 数据库中胶质瘤患者基因测序数据进行生物信息学分析，结果显示CBX3 在不同级别的胶质瘤中差异表达；低级别胶质瘤（LGG，n=530）中CBX3 的表达水平明显低于胶质母细胞瘤（GBM，n=166）（图1）。

图1 CBX3 在TCGA数据库中胶质母细胞瘤和低级别胶质瘤中表达量的差异Fig.1 Analyze the expression level of CBX3 in 166 GBM and 530 LGG patients from TCGA database

2.2 CBX3 在不同类型以及不同级别胶质瘤中表达情况

通过分析CGGA 数据库，我们发现胶质瘤的病理级别越高，CBX3 的表达量越高(图2)。

图2 CBX3 在CGGA 数据库不同级别胶质瘤中的表达情况Fig.2 Expression level of CBX3 in glioma patients from CGGA database

2.3 CBX3 表达与胶质瘤预后的关系

为了明确CBX3 表达量与胶质瘤患者预后的关系，接下来在CGGA 数据库获取初发胶质瘤222例，继发胶质瘤58例，通过Kaplan-Meier 分析证明在所有的初发型胶质瘤中，CBX3 高表达组预后显著差于其低表达组的预后（P＜0.0001）;在继发胶质瘤中，CBX3 高表达组预后同样低于CBX3低表达组(P=0.0021)(图3)。

图3 CGGA 数据库中CBX3 表达量与胶质瘤患者的生存分析 A: CGGA 数据库中各级原发性胶质瘤中CBX3 表达与预后的关系 B: CGGA 数据库中各级继发性胶质瘤中CBX3表达与预后的关系Fig.3 Survival analysis of CBX3 expression and glioma patients from CGGA databaseA:The relationship between CBX3 expression and prognosis in all grades of primary gliomas in the CGGA database；B: The relationship between CBX3 expression and prognosis in all grades of secondary gliomas in the CGGA database

2.4 CBX3 的GO 和Pathway注释

研究生物体中所有蛋白质（“相互作用体”）的蛋白质相互作用网络仍然是现代生物医学的主要挑战之一。此类信息对于理解细胞途径和开发用于治疗人类疾病的有效疗法至关重要。我们通过分析与CBX3 可能产生相互作用的蛋白来推测其在癌症发生发展中的作用我们筛选出靶向SND1 结合蛋白和CBX3 表达相关基因，用于一系列的途径浓缩分析。基于STRING，我们获得了50 个CBX3 结合蛋白，我们使用GEPIA2 工具结合TCGA 的所有肿瘤表达数据，获得了与CBX3 表达相关的前100 个基因。我们结合这150 个基因进行了GO 和KEGG 富集分析。图4 的GO 结果显示CBX3 参与的生物学过程包括有催化活性、组蛋白结合、DNA 解旋酶活性、DNA 依赖性ATP 酶活性、核苷酸转移酶活性、修饰依赖的蛋白质结合、启动子特异性染色质结合、组蛋白甲基转移酶活性、白质甲基转移酶活性、N-甲基转移酶活性等(图4) 。KEGG 结果表明CBX3 参与癌症中的转录失调、系统性红斑狼疮、剪接体、RNA 转运、嘧啶代谢、错配修复、DNA 复制等(图5)。

图4 CBX3 相关基因的GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of CBX3-related partners

图5 CBX3 相关基因的KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of CBX3-related partners

2.5 CBX3 的相互作用体富集分析

我们进一步分析与CBX3 可能产生相互作用的蛋白来推测其在癌症发生发展中的作用(图7)。对筛选出的10 个关键相互作用蛋白进行文献查询分析，以及进一步的GO 分析，发现其参与的生物过程涉及细胞凋亡、细胞趋化、炎症反应、细胞质翻译的负调控、肌动蛋白成核的负调节、细胞-基质粘附、前体代谢物和能量的产生等。其中参与细胞凋亡的互作蛋白在其中占据大多数，如TINF2/E2F6/L3MBTL2 等，这提示CBX3可能在细胞凋亡通路中发挥一定作用，为进一步揭示胶质瘤细胞凋亡的机制提供了新的依据。

图6 GO 富集分析的cnetmap图Fig.6 The cnetplot for the molecular function data in GO analysis

图7 相互作用富集分析图Fig.7 Interaction enrichment analysis plot

2.6 CBX3 对胶质母细胞瘤细胞系凋亡的影响

选择胶质母细胞系T98G 转入小干扰RNA 片段对CBX3 基因进行敲减，敲减的效率通过QPCR 和Western blot 实验验证。选择U87 进行CBX3 过表达细胞构建，将过表达质粒转入到细胞系中，然后用western 和QPCR 验证其过表达效率。接下来，为了研究敲减CBX3 后细胞的凋亡水平，进行了流式细胞术实验，与阴性对照NC组相比，敲减CBX3 后胶质母细胞系展现出较高的凋亡水平。而在U87 细胞系中过表达CBX3 可以显著降低细胞的凋亡水平。进一步通过western 检测凋亡相关蛋白水平表达情况发现，在T98G 细胞系中敲减CBX3 后，凋亡促进蛋白Bax和活化的Caspase-3 表达显著升高，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 表达显著降低。U87 细胞系中过表达CBX3 呈现出相反的趋势，表明CBX3 蛋白可以明显降低胶质母细胞瘤细胞系的凋亡水平（图8）。

图8 U87 和T98 中CBX3 的表达量与细胞凋亡水平和凋亡相关蛋白的关系A：Western blotting 检测T98G 中敲低CBX3 和U87MG 中CBX3 过表达后的蛋白表达B：Q-PCR 检测T98G 中CBX3 的敲低和U87MG 中CBX3 的过表达后RNA 水平 C：流式细胞仪检测T98G 中CBX3 敲低和U87MG 中CBX3 过表达后细胞凋亡能力的变化 D: Western blot 检测T98G 敲低CBX3 和U87MG 过表达CBX3 后Bcl-2/Bax/Cleaved-Caspase3 等凋亡指标蛋白的表达 ###P＜0.05 vs NC组Fig.8 The relationship between the expression of CBX3 in U87MG and T98G and the level of cell apoptosis and apoptosis-related proteinsA: Western blotting detects the protein expression after knocking down CBX3 in T98G and overexpression of CBX3 in U87MG; B:Q-PCR detection Knockdown of CBX3 in T98G and over-expression of CBX3 in U87MG; C: Flow cytometry to detect changes in apoptosis ability after knock-down of CBX3 in T98G and over-expression of CBX3 in U87MG; D:Western blot Detect the expression of apoptosis index proteins such as Bcl-2/Bax/Cleaved-Caspase3 after knocking down CBX3 in T98G and overexpressing CBX3 in U87MG;###P＜0.05 vs NC group

3 讨论

胶质瘤是成人最常见的原发性脑肿瘤，尽管外科手术、化疗和放疗改善了胶质瘤患者的预后，但其总体生存率仍然较低。随着影响肿瘤生物学功能的特定标志物的出现，胶质瘤的基因分析可以为患者提供更准确的诊断、治疗和预后信息[9]。在本研究中，我们分析了TCGA 数据库中不同级别胶质瘤组织中CBX3 的表达量，发现其在胶质母细胞瘤中显著上调，这意味着其在胶质瘤进展中可能起到一定的作用。

HP1 家族基因的异常表达可以诱发多种人类疾病，包括癌症的发展和机体缺陷。CBX3 作为HP1 的旁系同源物在表观遗传中起重要作用的蛋白质，在染色质结构和DNA 的修饰、连接组蛋白、转录沉默、DNA 修复和RNA 的甲基化标记等方面发挥重要作用[10]。Chang 及其同事证明，CBX3 在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中过表达和高CBX3 表达预测这些癌症患者的预后不良[11]。Slezak 等人指出CBX3 表达水平与Ki-67 表达水平呈正相关，这预测了前列腺癌患者的不良预后[12]。但目前CBX3 在胶质瘤中的作用并不清晰，我们通过生物信息学的预测和凋亡相关蛋白的检测，对可能的机制进行了探索。

在本研究中，TCGA 中的数据分析表明CBX3 在GBM 中的表达水平显著升高，并且伴随着胶质瘤级别的升高CBX3 的表达量也显著升高，表明CBX3 在胶质瘤中可能起到促癌作用，为治疗胶质瘤提供了一个可能的抑制靶点。此外，通过对CGGA 数据库进行CBX3 预后分析，结果提示高表达CBX3 患者其预后更差。这一结果也与上述不同级别胶质瘤中其表达量不同相一致，突出显示了CBX3 对胶质瘤发生发展的促进作用。许多疾病与甲基化信号传导功能有关，许多生物大分子，包括蛋白质和核酸，已被鉴定为HP1 结合伙伴。组蛋白H3（H3K9me3）的三甲基化赖氨酸9 残基是HP1 研究最深入的结合位点之一。CBX3 能首先与甲基化的H3K9 结合以建立一个平台，该平台又招募更多的组蛋白H3K9 甲基转移酶，这种异染色质形成的传播路径称为"自我维持环"，进一步在癌症的发生以及发展中发挥重要作用[13]。本文通过对CBX3 进行的GO 和Pathway 注释显示，同时发现CBX3 参与多种的生物学过程包括组蛋白甲基转移酶活性、蛋白质甲基转移酶活性、N-甲基转移酶活性、组蛋白结合、DNA 解旋酶活性、DNA 依赖性ATP 酶活性、修饰依赖的蛋白质结合、N-甲基转移酶活性等。进一步证明CBX3 在胶质瘤发生发展中可能起到的关键作用，对细胞生物过程的富集分析也同样可以为深入的机制研究提供理论支持。

胶质瘤发生是一个受肿瘤多样性、染色体不稳定性和基因改变影响的复杂过程。癌基因激活和肿瘤抑制器失活是胶质瘤致癌和进展的关键步骤[14]。而我们的研究显示CBX3 在剪接体、错配修复等通路发挥重要作用。同时对CBX3 的基因注释发现其参与组蛋白结合以及组蛋白修饰等，表征CBX3 作为促癌基因可能在胶质瘤的发生及进展中发挥重要作用。上述GO 富集分析表明CBX3 相互作用体细胞生物过程被富集在细胞凋亡过程。因此，CBX3siRNA 和过表达质粒被设计并用于胶质母细胞瘤细胞系的转染，以检测胶质母细胞瘤细胞系凋亡是否会受到CBX3基因表达水平的影响。结果表明，CBX3 表达的降低显著诱导了细胞凋亡。

综上所述，我们的研究结果表明，CBX3 对人胶质瘤的预后和进展具有重要意义。在CBX3 表达下调后，胶质母细胞瘤细胞系的凋亡水平明显升高，患者的生存期延长。因此，CBX3 可能可以作为胶质瘤治疗的潜在生物学靶点。