Klotho 蛋白抑制POCD 老年大鼠脑组织及小胶质细胞中FGF23/NF-κB p65 的表达

段海霞，王翀鹤，王庆辉，姜万维*，黄学洙*

1.大连大学附属中山医院麻醉科，辽宁 大连 116001；2.延边大学附属医院麻醉科，吉林 延吉 133002

术后认知功能障碍(Post-operative cognitive dysfunction,POCD)是指麻醉和手术后认知功能损伤，特别是学习和记忆，严重时可导致人格变化[1]。POCD 多发生于老年人，是术后的主要神经并发症，根据患者认知功能障碍的严重程度对患者的生活质量、社会独立性和死亡率均造成不同程度影响。衰老被认为是POCD 的独立危险因素，国际POCD 研究(ISPOCD)得出的结论，六十岁以上的患者术后7 d 内发生POCD 的概率约为26%，术后90 d 内发生POCD的概率约为10%[2]。麻醉和手术刺激炎症因子大量分泌是引起POCD 的另一项重要因素。七氟醚作为一种临床麻醉吸入性药物，广泛应用于各个年龄段的择期手术患者。然而，有证据表明，七氟醚可诱导POCD 的发生[3]。也有研究证实了七氟醚在神经系统炎症反应和凋亡中的促进作用，这与POCD 的发生密切相关[4]。klotho 又名克老素，是一种具有多效性的抗衰老基因。沉默klotho 基因的小鼠出现与人相似的早衰症状，包括多器官衰竭、认知障碍和寿命缩短[5]。klotho 能编码一种I 型跨膜蛋白，该蛋白在大脑脉络膜丛和肾小管上皮中高表达，具有较大的胞外结构域和较短的胞内部分。在分泌酶处理过程中，Klotho 蛋白可被分裂成细胞外和细胞内的形式[6]。游离的Klotho 蛋白被释放到脑脊液和血液中，发挥强大的抗氧化活性。一些研究已经报道了Klotho 蛋白在细胞中的抗炎作用，以及Klotho 的缺乏与慢性阻塞性肺疾病和肾损伤中炎症反应之间的关联[7]。本研究探讨了Klotho 蛋白在POCD 老年大鼠脑组织及小胶质细胞中的潜在作用，为临床POCD 的防治寻找新的靶点。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组与处理

本研究涉及动物实验经我校动物保健与使用委员会批准（YB.No20210622S030）。SPF 清洁级雄性SD 大鼠（20 个月龄，体重400±50g）饮食饮水充足，并在室温（22 ℃）下饲养，每天光照12 h。POCD 大鼠模型的建立方法如下[9]，将大鼠随机分为control组，七氟醚麻醉组（sevo组）、七氟醚麻醉手术组（sevo+surgery组），每组15 只。sevo+surgery组大鼠先用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定于脑立体定位仪（美国stoelting 公司），配合气体麻醉适配器（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），佩戴动物专用通气面罩，以4%七氟醚和2 L/min O2维持麻醉，经腹部正中做3 cm 切口，进行腹腔探查术，术后置于麻醉诱导箱，以麻醉通气流量2 L/min，4%七氟醚持续吸入3 h。sevo组大鼠不行手术，直接置于麻醉诱导箱，以麻醉通气流量2 L/min，4% 七氟醚持续吸入3 h。control组同样不予腹腔探查，直接置入麻醉诱导箱中，以空气/氧气混合通气3 h。

1.2 细胞培养

小胶质细胞（BV2）购自于丰晖生物（湖南;货号CL-0493），置于盛有DMEM（Thermo）和10% FBS（Biowest）、1%链霉素和青霉素的培养皿，37 ℃5%CO2培养箱中培养。POCD 环境的诱导采用了Jeong[10]研究中描述的方法，BV2 细胞以1×105/孔的密度铺于六孔板中，用1 μg/mL LPS 处理6 h 后，再用1 μg/mL Klotho（R&D 公司）孵育细胞24 h，随后立即将六孔板置于麻醉诱导室中，暴露于含30% O2、70%氮气、4%七氟醚中1 h。

1.3 水迷宫

大鼠经七氟醚麻醉结束后24 h，进行Morris 水迷宫（型号：DigBehv001，购自上海吉量软件科技有限公司）检验其认知功能状态。水迷宫共划分为4 个象限，可在任意象内设置隐蔽平台，我们将平台设置在第3 象限，然后随机将大鼠从任意象限放入恒温水中，记录大鼠120 s 内寻找水上平台时间(即逃避潜伏期) 。大鼠从4 个象限依次入水训练，每次训练时间间隔15 min，并记录4 d 内的逃避潜伏期。第5 天行空间记忆检测，即在撤去平台的情况下记录大鼠在被随意放入象限内，60 s 内的穿越平台次数及第三象限停留时间占比。

1.4 HE 染色

处死大鼠前，我们予以大鼠3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射，并进行心脏灌流。灌流结束后即刻在冰浴上将大鼠断头，于枕骨大孔处分离皮肤暴露头骨至双侧眼部，骨钳剥离头骨，逐步小心将大脑取出，注意在取出脑组织前应剪断视神经。用神经剥离子钝性分离覆盖在海马上方的大脑皮层，可见大鼠海马组织，小心取出后立即放入4%多聚甲醛固定液中完全浸入。记录编号后，将组织置于4 ℃冰箱内避光妥善保存，固定约48 h。固定后进行包埋、切片，对组织切片脱蜡、脱水后予以苏木素和伊红染色，再次脱水后封片，并使用玻片扫描仪（购自广州涞铂锐科技股份有限公司）进行拍摄。

1.5 TUNEL 凋亡检测

TUNEL 凋亡检测试剂盒购自于碧云天。组织切片脱蜡水化后，滴加200 μL 蛋白酶K 室温下孵育10 min，PBS 清洗后，加入TUNEL 反应液室温下孵育1 h，PBS 再次清洗，加入50 μL Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min，PBS 洗后滴加DAB 显色液反应10 min，PBS 再次清洗后进行苏木素复染，最后脱水、透明并封片，使用玻片扫描仪进行拍摄。

1.6 ELISA

根据ELISA 试剂盒（R&D）说明书的步骤，依次检测大鼠海马组织上清液和小胶质细胞BV2 中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量，并通过标准曲线计算其浓度。

1.7 Western blot

将大鼠海马组织蛋白裂解或BV2 细胞蛋白收集后测定蛋白浓度。每个泳道加入等量对应样本蛋白并启动电泳仪。将电泳后的蛋白转到pvdf 膜上，进行封闭，再加入稀释的一抗(OX-42、Klotho、FGF23、Phospho-NF-κB P65、NF-κB P65、p-IκBα、IκBα、GAPDH) 4 ℃过夜。洗膜后加入相应二抗再次孵育，再次洗膜后利用发光剂进行凝胶成像。

1.8 细胞免疫荧光染色

将细胞以1×105/孔密度均匀铺于6 孔板中，予以LPS、Klotho 重组蛋白、七氟醚处理后，用4%多聚甲醛固定，用1%牛血清白蛋白（albumin）封闭30 min，然后首先用抗NF-κB p65 抗体在4 ℃下染色过夜。随后，将BV2 细胞与AlexaFluor 488 偶联的Ⅱ抗在室温下孵育2 h。最后，染DAPI并在显微镜下观察拍照。

1.9 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.1.2 进行数据分析与作图，所有数据均采用表示，组间对比使用t 检验，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫评价POCD 老年大鼠认知功能

为验证POCD 大鼠模型的建立，我们采用Morris水迷宫试验检测了老年大鼠的认知功能。显然，与control组相比，sevo组和sevo+surgery组的大鼠逃逸潜伏期延长，在目标象限的时间缩短（均P＜0.01，图1A-C）。同时，该两组的大鼠平台穿越次数显著下降（P＜0.01，图1D）。其中，sevo+surgery组较sevo组大鼠在目标象限停留的时间更短（P＜0.05，图1C）。这些结果表明，七氟醚处理的大鼠表现出明显认知功能受损，而手术则可能加重老年大鼠的POCD。

2.2 POCD 老年大鼠脑组织病理及炎性因子改变

观察大鼠海马组织形态学变化，如图2A 所示，control组大鼠海马组织CA1 区神经元细胞整齐排列，细胞形态大小正常，细胞核清晰，细胞分布密集且规则，由于大鼠衰老，可偶见神经元细胞核深染。sevo组大鼠海马组织CA1 区神经元细胞虽然排列较为整齐，但大量细胞体大、变形，已经受损。行剖腹探查大鼠海马CA1 区神经元细胞受损更为明显，细胞密度下降且排列无规则，细胞结构不清晰，细胞核深染。在大鼠海马组织CA1 区的TUNEL 染色中我们发现，control组仅有少量TUNLE 染色阳性细胞，为细胞生理性死亡，sevo组部分细胞呈现TUNLE 染色阳性细胞，而sevo+surgery组大鼠海马组织中有大量TUNLE染色阳性的凋亡细胞，呈现棕黄色或棕褐色（图2B）。此外，我们用ELISA 方法检测了两组大鼠海马组织上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达水平。图2C 结果表明，与control组大鼠相比，sevo组和sevo+surgery组大鼠海马组织上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达水平明显升高（P＜0.01），其中，sevo+surgery组较sevo组各炎症指标升高更显著（P＜0.05）。

图2 大鼠体内炎症因子及病理组织变化A: HE 染色观察大鼠海马CA1 区组织病理学改变B:大鼠海马CA1 区TUNEL 染色C: ELISA 法测定大鼠海马组织上清液中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表达**P＜0.01，与control组相比 #P＜0.05，与sevo组相比Fig.2 Inflammatory cytokines and pathological changes in ratsA: HE staining was used to observe the histopathological changes in hippocampal CA1 region of rats; B: TUNEL staining of hippocampal CA1 region of rats; C: The expressions of IL-β、TNF-α and IL-6 in the supernatant of rat hippocampal tissue were determined by ELISA;**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs sevo group

2.3 POCD 老年大鼠脑组织内Klotho/FGF23/NF-κB表达情况

使用western blot 方法对大鼠海马组织进行检测。首先评估了POCD 老年大鼠海马组织中小胶质细胞的激活，如图3A 和3B 所示，sevo组和sevo+surgery组小胶质细胞激活特异性标志物OX-42 的表达较control组明显升高（P＜0.01）,且sevo+surgery组比sevo组OX-42 蛋白表达更显著（P＜0.05）。此 外，在 对POCD 老年大鼠海马组织Klotho/FGF23/NF-κB 信号轴蛋白的检测中发现，与control组大鼠相比，sevo组和sevo+surgery组的大鼠海马组织中Klotho 蛋白表达明显减低（P＜0.01），而FGF23 蛋白以及IκBα、NF-κB p65 的磷酸化表达显著升高（P＜0.01）。与sevo组比较，sevo+surgery组的大鼠海马组织中Klotho 蛋白表达更低（P＜0.05），而FGF23 蛋白和IκBα 的磷酸化则表达更高（P＜0.05），见图3。

图3 大鼠海马组织中Klotho/FGF23/NF-κB 通路蛋白表达A,B: Western blot 检测大鼠海马OX-42 的表达 C,D : Western blot 检测大鼠海马Klotho、FGF23、IκBα 和NF-κB 的表达 *P＜0.05,**P＜0.01，与control组比较 #P＜0.05，与sevo组比较Fig.3 The expression of Klotho/FGF23/NF-κB pathway protein in rat hippocampusA,B: Western blot was used to detect the expression of OX-42 in hippocampus of rat; C,D: Western blot was used to detect the expression of Klotho,FGF23,IκBα and NF-κB in hippocampus of rat;*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs sevo group

2.4 Klotho 蛋白通过抑制FGF23/NF-κB 降低小胶质细胞中炎症因子表达

为了检测POCD 条件下小胶质细胞中促炎细胞因子表达的影响，我们使用ELISA 检测了TNF-α、IL-1β和IL-6 的表达水平。如图4A 所示，经LPS 和七氟醚诱导后，BV2 细胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达显著增加(P＜0.01)。然而，Klotho 处理后抑制了POCD 条件下BV2 细胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达。此外，我们检测了BV2 细胞FGF23 蛋白和NF-κB p65 的磷酸化表达水平，图4B 和4C 可见，经LPS 和七氟醚诱导后，FGF23 蛋白和NF-κB p65 的磷酸化表达明显升高（P＜0.01），而Klotho蛋白可以抑制FGF23蛋白和NFκB p65 的磷酸化的表达。此外，我们在BV2 细胞的免疫荧光检测中发现，经LPS 和七氟醚诱导后的BV2 细胞明显活化，p65 的磷酸化明显上调且出现核内表达，而经Klotho处理后p65在BV2核内表达显著降低。

图4 Klotho 处理的BV2 细胞中炎症因子及FGF23/NF-κB 信号通路蛋白的表达A: ELISA 法测定BV2 细胞中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表达 B,C: Western blot 检测BV2 细胞中FGF23、IκBα 和NFκB p65 的表达 D:免疫荧光法检测BV2 细胞中NF-κB p65 的表达 **P＜0.01，与control组比较 ##P＜0.01，与LPS+sevo 相比较Fig.4 Expression of inflammatory cytokines and FGF23/NF-κB signaling pathway proteins in Klothotreated BV2 cellsA: The expressions of IL-β、TNF-α and IL-6 in BV2 cells determined by ELISA; B,C: Western blot was used to detect the expression of FGF23,IκBα and NF-κB p65 in BV2 cells; D: The expression of NF-κB p65 in BV2 cells detected by immunofluorescence;**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs LPS+sevo group

3 讨论

POCD 是老年患者术后最常见的并发症之一。麻醉后，手术引起组织损伤刺激外周免疫系统激活，外周免疫细胞可参与海马体的炎症反应，导致细胞因子级联和炎症介质的释放，引起POCD。研究表明，吸入麻醉促进动物模型中神经元细胞凋亡，降低学习能力和记忆[11]。七氟醚是一种吸入性麻醉剂，具有芳香气味和对呼吸道刺激较小的特点。既往研究表明，使用七氟醚麻醉的患者术中病情稳定，术后可迅速恢复，大大缩短了手术时间，改善了患者的镇痛效果[12]。然而，近年来，七氟醚被认为是POCD 的诱导因子[1]。在本研究中，我们发现单独行七氟醚麻醉以及七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠均表现出认知功能的显著降低。除此之外，我们进一步证实了在使用七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠体内炎症明显加重。已经有研究证实了炎症反应和细胞凋亡参与了POCD 的发病机制，Fan 等人[4]发现，七氟醚诱导后，POCD 儿童患者血清中caspase-3、TNF-α 和IL-6 水平显著升高。在本研究中，我们发现，予以七氟醚麻醉后老年大鼠海马组织中炎症因子IL-1β、TNF-α 和IL-6 表达明显上调，且七氟醚麻醉后行剖腹探查术的老年大鼠炎症因子表达更高。此外，七氟醚麻醉后行剖腹探查术的老年大鼠海马组织切片HE 染色和TUNEL 染色表明海马区神经元细胞严重受损，排列稀疏且无规则，并出现大量凋亡，这与阿尔茨海默症大鼠海马组织染色结果几乎一致[13]。综上说明七氟醚可以诱导老年大鼠发生POCD,而剖腹探查术则加重了老年大鼠发生POCD 的程度。

Klotho 是一种抗衰老基因，其表达随着年龄的增长而下降，提示其在衰老相关疾病的发病机制中起关键作用。成纤维细胞生长因子FGF23 作为调节矿物质离子及维生素D 稳态的关键激素，其受体FGFR 可与Klotho 相结合，Klotho 同时通过D3 结构域连接FGFR1c，通过c-末端尾部连接FGF23，形成由Klotho的脱落胞外域、FGFR1c 配体结合域和FGF23组成的三元复合物参与体内多种调节[14]。Guo[15]等人研究发现，FGF23 通过激活NADPH 氧化酶触发ROS 的产生并诱导NF-κB p65 磷酸化。此外，Klotho 还是一种抗炎调节因子，通过负调控NF-κB 减少促炎基因转导。NF-κB 是一种与免疫球蛋白基因中启动子调控区域结合的核因子。NF-κB 对与年龄相关的内皮氧化还原变化敏感，可激活促炎细胞因子的转录，进一步抑制内皮功能，在老年人内皮细胞中形成炎症和氧化应激的恶性循环。研究表明，外源性Klotho 可防止内皮细胞氧化应激和衰老，这种抗炎抗衰老作用似乎与Klotho 防止NF-κB 核易位有关[16]。本研究中发现，七氟醚麻醉以及七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠脑组织中Klotho 蛋白的表达明显下调，而FGF23 表达明显上调，IκBα 和NF-κB p65 磷酸化表达增加。虽然七氟醚及手术损伤如何影响大鼠脑部海马组织中Klotho 的蛋白含量仍不清楚，但有研究表明七氟醚可通过聚集免疫细胞透过血脑屏障[4]。因此，我们探究了脑组织中最重要的免疫细胞——小胶质细胞的激活状态，OX-42 蛋白是小胶质细胞活化的标志蛋白，在静息状态下几乎没有阳性表达，而本研究中发现，七氟醚麻醉以及七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠脑组织中OX-42 蛋白的表达显著升高，表明七氟醚和手术的刺激明显激活了老年大鼠脑组织中的小胶质细胞。

巨噬细胞是先天免疫的关键介质，全麻术后激活的巨噬细胞可浸润脑实质，诱导小胶质细胞活化和神经炎症。由此导致的促炎细胞因子表达的增加，尤其是在海马体内，最终导致认知功能障碍[17]。Zhou[18]等人发现，与野生型缺血性脑损伤小鼠相比，Klotho 基因过表达的小鼠脑损伤显著减轻，而慢病毒敲减Klotho 基因的小鼠缺血性脑损伤症状显著加重。此外，Klotho 过表达显著抑制脑缺血后炎症反应，表现为抑制胶质细胞过度活化，抑制RIG-I/NF-κB 信号激活，抑制促炎细胞因子的产生[19]。为进一步探究Klotho 对FGF23/NF-κB 的调控作用，同时为模拟临床麻醉术后发生POCD 的情况，我们用LPS 处理BV2 小胶质细胞诱导炎症状态，并用吸入麻醉剂七氟醚诱导细胞POCD 环境。本研究显示，在LPS 处理和七氟醚暴露后，BV2 细胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达显著增加，提示POCD 因这些促炎细胞因子的过量产生而加重，Klotho 蛋白处理降低了POCD 条件下TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达，提示Klotho 可能是一种内源性神经保护剂，以对抗手术引起的炎症损伤。此外，LPS 和七氟醚暴露诱导POCD 后，FGF23 的表达明显升高，IκBα 和NF-κB p65 磷酸化增加，而Klotho 处理后，抑制了BV2 细胞中FGF23 的表达以及IκBα、NFκB p65 的磷酸化。以上结果表明，Klotho 可能通过抑制FGF23/NF-κB 信号通路蛋白的表达，抑制促炎细胞因子并缓解细胞损伤，最终改善老年大鼠的术后认知功能障碍。

总之，Klotho 在POCD 老年大鼠海马组织中明显降低，且显著缓解LPS 和七氟醚诱导的小胶质细胞损伤，降低小胶质细胞中炎症因子释放，其作用机制可能与阻滞FGF23/NF-κB 信号通路蛋白的表达有关。因此，Klotho 可能为临床老年人POCD 的治疗提供新的方向。