生色底物法测定肝素钠的效价

郝士婧 张黎 王琪

（上海上药第一生化药业有限公司 上海 200240）

肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物[1-2]。

中国药典2020年版、美国药典、欧洲药典均收录了生色底物法测定肝素钠的效价[3-5]，文献所报道的内容多侧重于生色底物法与兔全血法进行方法对比[6-7]，抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子反应特性[8-9]，减少实验试剂用量的研究[10-12]等。本研究使用两种不同的测试手段进行生色底物实验，考察两种手段的实验特性，对比实验结果，给实验室提供更加合适的实验方案。

实验生色底物法利用生色底物在特定可见光下的吸光度来定量反应程度，可见光和吸光度可以由紫外可见分光光度计或酶标仪两种技术手段提供，由于方法采用了生物检定量反应的平行线法，考虑酶标仪样品池恒温并且一次多量的读数方式更为便捷，但得到的数据可信限率经常在5%以上[6-7]。采用紫外可见分光光度计需配备另外的恒温装置，由于紫外可见分光光度计所需求的待测溶液量较大，操作方法更复杂，相应的实验成本也较高。实验室拟考察采用紫外可见分光光度计和酶标仪两种方法，对比它们的便捷程度、实验成本、结果可靠信和可信限率。

1 材料和方法

1.1 实验原理

血液中Ⅱa因子和Ⅹa因子起到了凝血作用的90%以上，生色底物法就是测定肝素钠抗Ⅱa因子活性和抗Ⅹa因子活性。肝素钠激活抗凝血酶，被激活的抗凝血酶与加入的凝血酶反应，随即在体系中加入过量的生色底物，底物与未发生反应的抗凝血酶结合，而体系中剩余的生色底物在一定的波长下有光吸收，可经过测定定量，即可反推出体系中的抗凝血作用量[9-11]。原理示意图见图1。

图1 生色底物实验原理示意图

1.2 实验仪器及试剂

UV2550/UV2700型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；Spectra Max M2型酶标仪（美国Molecular公司）；中国药典生物鉴定统计程序BS2000。

发色底物S-2238和S-2765、抗凝血酶Ⅲ（10 IU）、Ⅹa因子（71 nkat）（Chromogenix公司）；Ⅱa因子（580 IU，Hyphen BioMed公司）；三羟基氨基甲烷（国药集团化学试剂有限公司-沃凯）；聚乙二醇6000（国药集团化学试剂有限公司）；肝素钠原料药（东营天东制药有限公司提供）；肝素钠注射液（上海上药第一生化药业有限公司生产）。

1.3 实验方法

1）紫外可见分光光度法（UV-VIS） 根据CHP2020，抗Ⅱa因子效价测定：样品与标准品分别配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待测液，抗凝血酶0.25 IU/mL，凝血酶5 IU/mL，底物0.625 mmol/L。使用紫外可见分光光度法，反应在37 ℃恒温水浴中进行，顺次加入标准品/样品100 μL，抗凝血酶100 μL，凝血酶200 μL，底物 200 μL，反应终止剂50%醋酸200 μL，每隔12 s顺次加入反应试剂。在405 nm波长处测定吸光度，需平行测定两次。

2）酶标仪法（ELIASA） 样品与标准品分别配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待测液，抗凝血酶0.25 IU/mL，凝血酶5 IU/mL，底物0.625 mmol/L。使用酶标仪，反应温度37 ℃，利用酶标仪自带的加热摇匀功能混匀。顺次加入标准品/样品25 μL，抗凝血酶25 μL，凝血酶 50 μL（16 IU/mL），底物 50 μL，反应终止剂50%醋酸200 μL，反应试剂的加入采用8通道移液枪差量加入法。在405 nm波长处测定吸光度，平行测定两次。

3）抗Ⅹa因子效价测定 样品与标准品分别配置成0.049 0、0.034 3、0.024 0、0.016 8 IU/mL的待测液，抗凝血酶1 IU/mL，Ⅹa因子0.4 IU/mL，底物1 mmol/L。反应方法参考抗Ⅱa因子效价测定方法[3]。

检测数据通过BS2000统计得出实验结果，当实验数据的回归P值小于0.01，偏离平行P值大于0.05，二次曲线P值大于0.05，反向二次曲线P值大于0.05，且可信限率（FL）小于10%时实验数据有效。

2 结果

2.1 UV-VIS测定肝素钠效价

测定了3批原料药和3批针剂的抗Ⅱa因子效价（表1）和Ⅹa因子效价（表2）。其线性回归、偏离平行、二次曲线和反向二次曲线的P值均达到中国药典2020年版四部通则1431生物检定统计法可靠性测验的要求，而可信限率值和相对标准偏差均较小。

表1 UV-VIS测定抗Ⅱa因子效价

表2 UV-VIS测定抗Ⅹa因子效价

2.2 ELIASA测定肝素钠效价

同样测定了3批原料药和3批针剂的抗Ⅱa因子效价（表3）和Ⅹa因子效价（表4）。其线性回归、偏离平行、二次曲线和反向二次曲线P值均达到要求，可信限率值小于10 %，相对标准偏差小于4 %。

表3 ELIASA测定抗Ⅱa因子效价

表4 ELIASA测定抗Ⅹa因子效价

2.3 两种方法结果对比

两种检测方法所获数据的对比表明，其所测效价较一致，相对标准偏差在2%左右。UV-VIS的平均相对标准偏差比ELIASA小2%左右，其实验重现性较好；UVVIS的可信限率较ELIASA小5%，故其实验数据较准确可信。不过，ELIASA的检测用时明显小于UV-VIS（表5）。

表5 两方法测定肝素钠效价的比较

3 讨论

相较于文献中使用更多的ELIASA测定法[6-10]，UV-VIS的可信限率明显更低，实验数据较准确可信。UVVIS法需按待测顺序每隔12 s顺次加入反应试剂，并进行手动混均，共计54次，对时间准确性要求和实验人员操作要求较高。

UV-VIS由于需要的待测溶液量较大，所以实验成本较高，但在使用了石英黑壁微量比色皿，并在样品池中加垫片后可大大减少待测溶液用量，大幅降低实验成本，可弥补UV-VIS试剂成本较高的缺陷。

无论采用UV-VIS还是ELIASA，生色底物法测定肝素钠效价可获得较精准的测定数据，所采用的仪器设备和试剂试液相较于生物测定兔全血法更易于操作控制，实验误差可控。两种方法均可获得可靠有效的检测数据，有较好的实验室可行性。同时对两种实验方法的不断优化提出了进一步要求，即进一步降低UV-VIS法操作难度，进一步降低ELIASA测定法的可信限率等。