山羊β防御素124定位及过表达附睾头上皮细胞系的建立

黄鑫芸，张俊梅，邰苗苗，2，孟繁荣，任有蛇，张春香，2

（1.山西农业大学 动物科学学院，山西 太谷 030801；2.河南省农垦发展服务中心，河南 郑州 450003）

β防御素是动物机体内一类重要的内源性且具有先天免疫作用的抗菌肽。在雄性动物生殖器官中表达的β防御素种类最多，且具有明显的物种差异[1-6]。人[1]、鼠[2]、猪[4]、绵羊[5]和山羊[6]生殖器官中分别表达有38、35、29、34、32种防御素，它们不仅发挥抗菌作用[7]，同时也在精子成熟过程中发挥重要作用[8-9]。β防御素124（BD124）是羊附睾头中表达量最高的β防御素[5-6]，附睾头BD124是山羊23种组织中表达量最高的β防御素[10]，对于揭示其生物学功能具有重要意义。2015年，张春香等[11]用生物信息学方法预测出山羊附睾头BD124有4个磷酸化位点，可能具有生物调节作用。基因过表达和敲减等方法是研究蛋白质功能的主要方法[12-13]。2014年，KIM等[14]将商业化BD124过表达质粒载体BD124-DDK-Myc转染到前列腺上皮RWPE-1细胞中，结果发现，BD124过表达增加了细胞因子白细胞介素6（IL-6）和12（IL-12）的表达。2020年，孟繁荣等[15]用BD124敲减的RNAi慢病毒载体转染山羊附睾头细胞，发现BD124通过调控p38MAPK/AP1通路影响先天性免疫。目前，尚未见有山羊BD124过表达载体构建的报道。

本研究首先对附睾头上皮细胞进行BD124定位，并进一步进行BD124过表达载体及过表达附睾头上皮细胞系构建，旨在深入研究其生物学功能，为BD124抗菌肽产品开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试太行山羊附睾头上皮细胞系和pEX1-EGFP-BD124质粒由山西农业大学动物科学学院动物繁殖实验室提供，鼠源BD124单克隆抗体和兔源多克隆抗体由山西农业大学动物科学学院羊繁殖生理研究课题组制备。DAPI、FITC-羊抗鼠IgG、无菌PBS购自博士德生物工程有限公司，NotⅠ和BamHⅠ内切酶购自Takara生物工程公司，DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶购自赛默飞世尔科技公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，重组克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

主要仪器设备有TCS SP8激光共聚焦显微镜（德国徕卡仪器有限公司），Odyssey®CLX双色近红外成像系统（美国LI-COR Biosciences）。

1.2 试验方法

1.2.1 山羊BD124蛋白定位方法 用1%多聚赖氨酸包被直径为12 mm的细胞爬片，将包被后的细胞爬片放入24孔细胞培养板内培养，随后用太行山羊附睾头上皮细胞铺板，待细胞生长1 d后，取出细胞爬片，用PBS冲洗3次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定30～40 min后用PBS洗涤，用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液煮沸5 min，室温冷却后用PBS洗涤，37℃恒温条件下用山羊血清封闭1 h后甩掉封闭液，在样品孔滴加BD124单克隆抗体（1∶100）稀释液后4℃孵育过夜。设置PBS孵育组为对照，第2天取出孵育组细胞爬片后在37℃复温1 h，再用PBS洗涤，滴加FITC-IgG二抗（1∶100）后用锡箔纸包裹，37℃恒温箱孵育30 min，PBS洗涤后滴加40 μL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），锡箔纸包裹后37℃孵育10 min，PBS洗涤，最后用抗荧光衰减剂封片，用激光共聚焦显微镜拍照。

1.2.2BD124过表达载体构建 以pEX1-EGFPBD124质粒为模板，用添加LV5的EF-aF//绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）和嘌呤霉素（Puromycin，Puro）载体NotⅠ和BamHⅠ酶双侧同源序列的引物序列（表1）扩增山羊BD124的全长序列。扩增体系组成（50 μL）：10×Buffer（＋Mg2＋）5.0 μL、上下游引物和dNTP各1.0 μL、模板1.0 μL、DNA聚合酶0.3 μL、ddH2O 40.7 μL；PCR反应产物经琼脂糖电泳后切胶回收备用。用内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶将穿梭质粒LV5载体线性化。酶切体系组成（25 μL）：BamHⅠ和NotⅠ酶各0.5 μL、LV5质粒模板7.0 μL、10×Buffer 3.0 μL和ddH2O 14.0 μL，37℃孵育2 h后回收线性化LV5载体。按重组克隆试剂盒说明书将BD124克隆到LV5载体上，然后将连接产物转化感受态细胞，37℃培养16 h。挑取阳性克隆后摇菌并保存菌液。抽取20.0 μL菌液送北京华大基因公司测序，确认测序结果与山羊BD124质粒序列一致后，用阳性克隆菌液摇菌后进行质粒提取备用，即为LV5-BD124重组穿梭质粒，将BamHⅠ和NotⅠ双酶切质粒采用琼脂糖电泳鉴定。

1.2.3 LV5-BD124过表达载体慢病毒包装 在6 cm培养皿中培养293T细胞，在融合度达80%～90%时，用胰酶消化离心收集后细胞，加入2 mL含DMEM的完全培养基，轻轻吹打为单细胞悬液。将该悬液接种到10 cm的培养皿中，加入12 mL完全培养基后在37℃、5%浓度的CO2环境下培养过夜。将4.5 μg重组穿梭质粒LV5-BD124、4.5 μg包装质粒（pRev+pMDL+pVSV-G，比例为2∶5∶3）和20.0 μL Fugene HD转染试剂与1.2 mL无血清DMEM混匀，室温放置30 min，滴加到239T细胞后加入5 mL无血清DMEM，37℃、5%CO2下孵育6 h，吸出弃上清后用12 mL完全培养基继续培养72 h，收集上清，过滤后4℃下20 000 r/min超速离心2 h，分装后在-80℃保存备用。用有限稀释法进行病毒滴度检测。

1.2.4 LV5-BD124慢病毒载体侵染条件优化 将对数生长期山羊附睾头上皮细胞铺到96孔板中用于筛选最佳病毒侵染浓度和最佳侵染体系，侵染体系分为添加0、5.0 μg/mL Polybrene（聚凝胺）2组，慢病毒添加设定MOI值（侵染病毒数目与细胞数量的比值）为1、10、100等3个。当细胞融合率达40%时，用包装好LV5-BD124慢病毒进行侵染，每组3个重复，24 h后换成完全培养基，72 h后拍照观察荧光信号强度。

1.2.5 重组LV5-BD124病毒载体过表达效果分析 选择最佳慢病毒载体浓度用于后续试验。采用24孔板，设置LV5-BD124过表达组（LV5-BD124）、LV5空载体组（LV5-NC）和对照组（Blank），侵染后96 h收集细胞用于提取mRNA并进行BD124荧光定量分析（引物如表1所示）。120 h后收集细胞用于提取蛋白，Western blot检测BD124蛋白过表达情况，一抗孵育浓度1∶2 000，荧光二抗孵育浓度1∶20 000，获取图像后用Image Studio软件分析灰度值。

表1 PCR所用引物Tab.1 Primes for PCR

1.2.6 重组LV5-BD124过表达上皮细胞稳转系建立 重组LV5-BD124过表达载体侵染附睾上皮细胞72 h后吸出培养基，用PBS冲洗。参考邰苗苗等[16]的方法更换为含有嘌呤霉素2.0 μg/mL不含青链霉素双抗的完全培养基进行阳性细胞筛选，胰酶消化72 h后，收集细胞，转至培养瓶中继续培养，48 h后进行第2次筛选，直至细胞融合度达80%～90%时进行传代培养。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0中的ANOVA程序分析荧光定量和蛋白灰度值，用Duncan法多重比较后采用GraphPad Prism 5作图。

2 结果与分析

2.1 附睾头上皮细胞BD124蛋白定位

采用共聚焦激光显微技术用单克隆抗体对附睾头上皮细胞BD124蛋白进行免疫荧光定位，结果如图1所示，山羊BD124蛋白在细胞核周围高度聚集，在细胞质和细胞核内均有分布；而对照组无荧光信号，结果可靠。

图1 山羊附睾头上皮细胞BD124的免疫定位Fig.1 Immunolocalization of BD124 in the epididymal caput epithelial cells of goats

2.2 BD124过表达载体构建与鉴定

2.2.1 LV5-BD124过表达慢病毒载体构建LV5-BD124过表达载体经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后的琼脂糖电泳结果如图2所示，在200 bp和8.0 kb附近可见2条清晰条带，与山羊BD124 CDS区片段长度207 bp相符，与LV5载体9.3 kb的片段长度基本相符。

图2 LV5-BD124载体双酶切胶Fig.2 Double enzyme digestion of LV5-BD124 vector

菌液测序结果如图3所示，经比对，测序结果与NCBI中山羊BD124的CDS区序列（KC763800.1）完全一致。说明BD124已成功克隆到LV5穿梭质粒载体中。用LV5-BD124穿梭质粒与包装质粒分别转染293T细胞后，收集病毒，采用有限稀释法测定LV5-BD124慢病毒载体的病毒滴度为3.0×108TU/mL。

图3 LV5-BD124载体双酶切测序结果Fig.3 Sequencing map of double enzyme digestion of LV5-BD124 vector

2.2.2 LV5-BD124慢病毒载体侵染条件优化 山羊附睾头上皮细胞在LV5-BD124慢病毒载体侵染72 h后荧光表达情况如图4所示，添加5 μg/mL Polybrene的侵染体系可极大提高侵染效率，且当MOI值为100时，本体系中具有荧光的阳性细胞数超过80%。后续试验均采用本侵染体系和MOI值。

图4 LV5-BD124慢病毒载体侵染72 h荧光情况Fig.4 The fluorescence intensity after 72 h of LV5-BD124 lentivirus vector infection

2.2.3 重组LV5-BD124过表达效果分析 荧光定量PCR结果和Western blot蛋白定量结果如图5所示。图5-A结果显示，LV5-BD124转 染96 h后山羊附睾头上皮细胞BD124 mRNA表达量显著升高（P＜0.05）；图5-B中Western blot结 果 显 示，LV5-BD124慢 病 毒 载体侵 染120 h后，BD124蛋 白条带比空白对照和空载体对照组的蛋白条带更深更粗；图5-C灰度值分析显示，LV5-BD124慢病毒侵染后，BD124蛋白表达量显著升高（P＜0.05），说明经重组LV5-BD124慢病毒载体侵染后BD124蛋白在山羊附睾头上皮细胞中过表达。

图5 LV5-BD124侵染后BD124 mRNA和蛋白的表达Fig.5 Expression of BD124 mRNA and protein after LV5-BD124 infection

2.3 BD124过表达附睾头上皮细稳转系的建立

BD124过表达附睾头上皮细胞系的建立过程如图6所示，重组LV5-BD124载体侵染附睾上皮细胞24 h后，从绿色荧光表达情况可以看出，BD124首先围绕细胞核形成荧光圈，但细胞核区内和细胞质中也有表达，支持BD124蛋白定位结果；侵染72 h后细胞融合度达80%，荧光强度增加，经2 μg/mL嘌呤霉素2次筛选后，阳性细胞密度高而且荧光强度增加。第2次传代培养后120 h，阳性细胞形态和荧光强度正常，可以正常传代。

图6 BD124过表达附睾头上皮细胞稳转系建立Fig.6 Construction of BD124 overexpressed stable cell strain of epididymal caput epithelial cells

3 结论与讨论

BD124在山羊附睾头细胞中高表达，附睾头是精子成熟的主要场所，高表达BD124蛋白在附睾头发挥的生物学功能应进行深入研究。据研究报道，蛋白质亚细胞定位与生物学功能的预测有密切关系[17-18]。张春香等[11]用生物信息学方法进行BD124亚细胞定位预测发现，该蛋白可能在线粒体中表达，但用生物信息学软件进行蛋白质亚细胞定位是根据提供的BD124氨基酸序列使用特定算法进行预测，只能作为一个参考。

本研究中，采用BD124单克隆抗体细胞免疫荧光定位发现，BD124在附睾头上皮细胞核和细胞质中均可以表达，另外用LV5-BD124慢病毒载体侵染细胞后，最初在细胞核膜周围形成一个BD124蛋白环，随着时间延长蔓延至整个细胞。上述结果与KIM等[14]用BD124过表达质粒载体转染前列腺上皮RWPE-1细胞后BD124蛋白分布结果一致，说明BD124除具有防御素本身的抗菌作用外，还具有其他生物学功能。孟繁荣等[15]研究结果也证实，BD124敲减后可引起附睾头细胞细胞因子基因和蛋白表达的变化。但BD124与何种配体相互作用激活下游信号通路，仍需进一步深入研究。

BD124蛋白定位虽可预测该蛋白的功能，但运用基因过表达或敲除技术构建基因过表达或敲除体外细胞模型或动物模型则是研究其生物学功能的主要方法[19-21]。常用的构建过表达载体的方法有2种：质粒载体法和病毒载体法。其中，质粒载体法在实验中使用较多[22-24]，较为简单，但缺点是在有些细胞中转染效率比较低，且附睾头细胞是质粒载体难转染的细胞。前期试验中已构建了过表达pEX1-EGFP-BD124质粒载体，尝试了不同的脂质体、细胞比例、转染时间和多种转染试剂，但转染效率始终非常低。参考KIM等[14]将商业化的过表达载体质粒转染到前列腺上皮RWPE-1细胞系中的成功案例，本试验将pEX1-EGFP-BD124转染到293T细胞中，荧光表达效果较好，说明质粒载体构建成功。

慢病毒是一类能高效整合并长期稳定表达长片段外源性目的基因，生物安全性高且可操控性强的重组反转录病毒载体，可高效侵染神经元细胞、心肌细胞、内皮细胞等多种类型细胞，成为理想的基因转移载体，同时也是现代体内基因治疗首选载体[25-28]。用Polyfect-V脂质体介导慢病毒空载体侵染山羊附睾上皮细胞后发现转染效率较高，说明慢病毒载体能成功转入附睾头上皮细胞。因此，本试验选择了携带2个标记基因GFP和Puro的LV5载体。GFP表达一方面可用于对包装病毒进行滴度测定，也可用于检测阳性细胞数量和检测转染效率。Puro基因在阳性细胞中表达，未侵染成功的细胞则被嘌呤霉素杀死[16]，大部分试验采用单次筛选法[27-28]。本试验采用嘌呤霉素进行2次筛选提高以BD124过表达的阳性细胞纯度，传代等过程处理后过表达附睾头上皮阳性细胞的过表达能力仍然很好保持，说明成功构建了BD124过表达附睾头上皮细胞系。BD124过表达将引发的细胞信号通路变化有待深入探究，同时也需进一步分析比较BD124敲减后与过表达后通路的变化，以期为将来科学开发利用BD124奠定理论基础。