干扰RBL2基因对绵羊卵泡颗粒细胞增殖的影响

陈春路，成 颖，马晓燕，党文庆，贾凯琪，郭翔宇，吕丽华

（山西农业大学 动物科学学院，山西 太谷 030801）

卵泡的生长发育对于雌性动物的生育能力有重要影响。羊一生可产生100万个卵泡，但只有不足5%的卵泡最终会发育成成熟卵泡，超过95%的卵泡会发生闭锁，所以降低卵泡闭锁率对提高动物生殖能力极为重要[1-5]。颗粒细胞（GCs）是卵泡中重要的体细胞，GCs与卵母细胞通过卵母细胞衍生因子之间建立联系，颗粒细胞对卵母细胞和卵泡的发育具有重要作用，进而影响雌性动物的生殖能力[6]。HE等[7]研究表明，颗粒细胞的增殖、分化、凋亡和激素分泌与卵泡的正常发育与闭锁密切相关。对于牛[8]、大鼠[9]、绵羊[10]的研究都证实，卵泡闭锁的重要原因是颗粒细胞的凋亡。人视网膜母细胞瘤基因（Retinoblastoma，RB）是一个发现较早的抑癌基因,因其首先在视网膜母细胞瘤中被发现而命名。相关研究表明[11-13]，RB基因家族与肺癌、前列腺癌和神经胶质母细胞瘤等较多肿瘤的发生有关。RB蛋白是肿瘤抑制因子,在细胞周期调节以及细胞分化、衰老和凋亡中起关键作用，但是其功能在绝大多数肿瘤中丧失[14]。视网膜母细胞瘤样蛋白2（Retinoblastoma-like protein-2，RBL2/p130）是RB家族中一个关键肿瘤抑制因子，可影响正常的细胞周期[15-18]，且具有抗凋亡的功能[18]。CHEN等[19]研究表明，下调LINC00899可通过RBL2影响FOXO通路，抑制脊髓室管膜瘤细胞的侵袭和迁移。ZHU等[15]通 过miR-17-5p与RBL2的 靶 标 关 系，提 高miR-17-5p的表达量来降低细胞中RBL2表达，从而影响正常的细胞周期，起到促进细胞增殖的作用。SHI等[20]研究表明，在肾癌细胞中，TGF-β能够诱导RBL2表达，抑制癌细胞增殖。然而，RBL2对绵羊卵泡颗粒细胞增殖的影响还不清楚。

本研究通过在绵羊卵泡颗粒细胞中转染siRBL2，阐明干扰RBL2对绵羊卵泡颗粒细胞增殖、凋亡、抗氧化及类固醇类激素合成的影响，旨在为解析促进卵泡发育机理提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

在山西省太谷区某屠宰场采集150只大尾寒羊卵巢，将卵巢保存在4℃含1%双抗的DPBS中，用75%酒精清洗2次，再用灭菌的DPBS将残余酒精冲掉，用灭菌的眼科剪将卵泡剪下，待后续试验使用。

1.2 主要试剂

DMEM/F12（武汉博士德生物工程有限公司），胎牛血清（赛澳美细胞技术有限公司），Lipofiter3.0（汉恒生物科技有限公司），RNAiso Plus和反转录试剂盒（大连TaKaRa公司）,双抗（北京索莱宝科技有限公司），CCK8试剂盒（MedChem Express）,ELISA检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司，江苏），PerfectStart®Green qPCR SuperMix（北京全式金生物有限公司，北京），RBL2干扰RNA（siRBL2）片段以及siRNA NC（上海吉玛制药技术有限公司，上海），合成的RNA序列如表1所示。

表1 siRBL2和NC序 列Tab.1 siRBL2 and NC sequences

1.3 试验方法

1.3.1 绵羊卵泡颗粒细胞的收集与培养 选择直径为3～5 mm的卵泡，剪下后用75%的酒精消毒后置于DMEM/F12基础培养基中，再用细胞刮及1 mL的无菌注射器将卵泡颗粒细胞刮出，于1 000 r/min离心5 min，弃上清后收集颗粒细胞，用无菌PBS重悬后离心，重复清洗3次。清洗后用DMEM/F12基础培养基+1%双抗+10%FBS的完全培养基重悬混匀，并将悬液分装于不同规格的培养皿中。

1.3.2siRBL2的转染 将卵泡颗粒细胞接种于6孔板中，待细胞融合率达到60%～70%时，用Lipofiter 3.0分别将siRNA NC和siRBL2转染到绵羊卵泡颗粒细胞中，6 h后，采用完全培养基继续培养，48 h后进行基因水平和类固醇类激素水平的检测。

1.3.3 引物设计 采用NCBI中Primer-BLAST在线软件设计RBL2、细胞增殖、凋亡、抗氧化及类固醇类激素合成相关基因的引物，选择β-actin为内参基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 基因引物序列Tab.2 Gene primer sequences

续表2基因引物序列Tab.2（Continued）Gene primer sequences

1.3.4 qRT-PCR反应 总RNA提取和反转录为cDNA的过程均按照TaKaRa公司的产品说明书操作。反转录合成cDNA的过程参照PerfectStart®Green qPCR SuperMix说明书进行。反应体系为10.0 μL：上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、5.0 μL的2×PerfectStart®Green qPCR SuperMix和4.6 μL Nuclease-Free Water。反应程序按照说明书上的3步法进行。

1.3.5 CCK8检测 采用CCK8试剂盒检测细胞存活率。将颗粒细胞接种于96孔板中，待细胞融合率达到60%～70%时，用Lipofiter 3.0将siRNA NC和siRBL2转 染 颗 粒 细 胞，6 h后，将DMEM/F12换成完全培养基。培养0、12、24、36、48 h后，更换完全培养基，每孔加入10.0 μL的CCK8，37℃孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的OD值，计算转染后不同时间段的细胞存活率。

1.3.6 ELISA细胞接种于6孔板中，转染siRBL2后48 h收上清。加入样品和标准品，37℃孵育30 min，洗板5次后加入酶标试剂，37℃孵育30 min，洗板5次后，37℃显色10 min，终止反应，15 min之内读取样品OD值。采用标准曲线计算出样品中E2和P4实际浓度。

1.4 数据分析

采用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量（取3次计算的平均值）。所有数据用平均数±标准差表示。在SPSS 22.0中运用t检验和单因素（ANOVA）方差分析差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 siRBL2转染效率的检测

合成的siRBL2的转染效率如图1所示，与空白对照组相比，siRBL2的表达量显著下降（P＜0.01），说明干扰效果较好。

图1 siRBL2转染效率检测结果Fig.1 siRBL2 transfection efficiency test results

2.2 siRBL2对细胞周期相关基因的影响

干扰RBL2后检测细胞周期相关基因的表达量，结果如图2所示。

图2 siRBL2对绵羊卵泡颗粒细胞周期相关基因表达的影响Fig.2 Effects of siRBL2 on cycle-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

从 图2可 以 看 出，FOXO3a和CCND1的 表 达量显著升高（P＜0.05），P21和P27这2个基因的表达量显著下降（P＜0.05）。表明干扰RBL2可能对细胞增殖有促进作用。

2.3 干扰RBL2对凋亡相关基因的影响

干扰RBL2检测细胞凋亡相关基因，结果如图3所示，与空白对照组相比，BCL-2的表达量差异不显著，但有升高的趋势；BAX、BAD和Caspase3基因的表达水平显著下降（P＜0.05），BCL-2/BAX的值极显著上升（P＜0.05）。说明干扰RBL2可能抑制细胞凋亡。

图3 siRBL2对绵羊卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响Fig.3 Effects of siRBL2 on apoptosis-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

2.4 干扰RBL2对抗氧化相关基因的影响

转染siRBL2后检测抗氧化相关基因的表达量，结果表明（图4），CAT和SOD2基因的表达量显著上升（P＜0.05），提示siRBL2可能有助于提高绵羊卵泡颗粒细胞的抗氧化能力。

图4 siRBL2对绵羊卵泡颗粒细胞抗氧化相关基因表达的影响Fig.4 Effects of siRBL2 on antioxidation-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

2.5 细胞增殖能力的检测

用siRNA NC和siRBL2转染颗粒细胞，分别在0、12、24、36、48 h用酶标仪测定450 nm处的吸光度，计算细胞存活率，结果显示（图5），转染后12 h，siRBL2对细胞活力影响不显著，转染24、36、72 h后差异显著（P＜0.05）。说明siRBL2可能促进绵羊卵泡颗粒细胞的增殖。

图5 CCK8检测细胞增殖结果Fig.5 Cell proliferation detected by CCK8

2.6 siRBL2对类固醇类激素合成的影响

细胞转染48 h后收集上清，检测E2和P4水平，结果表明（图6、7），E2水平显著上升（P＜0.05），P4水平显著下降（P＜0.05）。同时采用qRT-PCR检测类固醇激素合成相关基因的表达量，结果显示（图8），3β-HSD和STAR基因的表达量显著下降（P＜0.05），CYP11A1的表达量差异不显著，但有下降趋势；CYP19A1的表达量显著上升（P＜0.05）。说明干扰RBL2能够提高E2水平，降低P4水平。

图6 siRBL2对绵羊卵泡颗粒细胞中雌激素（E2）水平的影响Fig.6 Effects of siRBL2 on the level of estrogen（E2）in sheep follicular granulosa cells

图8 siRBL2对类固醇类激素合成相关基因的影响Fig.8 Effects of siRBL2 on genes related to steroid hormone synthesis

图7 siRBL2对绵羊卵泡颗粒细胞中孕激素（P4）水平的影响Fig.7 Effects of siRBL2 on the level of progesterone（P4）in sheep follicular granulosa cells

3 结论与讨论

卵泡的发育状态对雌性动物的生殖能力具有重要影响且受多种因素调控。雌性动物的大部分卵泡会发生闭锁，只有少数卵泡可发育至正常排卵，而颗粒细胞是卵泡中具有重要功能的体细胞。颗粒细胞通过间隙连接为卵母细胞提供营养并进行信号转导，特别是雌激素和黄体酮等类固醇激素，对卵泡的生长发育起到重要作用[21]，所以颗粒细胞的凋亡对卵泡闭锁具有重要影响。卵巢中类固醇类激素主要在颗粒细胞和卵泡膜细胞中产生[22]。在卵巢中，卵泡外部的膜细胞能够分泌雄激素，雄激素被颗粒细胞芳香化为雌二醇，在此转化过程中作为编码雌激素合成酶的CYP19A1基因起到至关重要的作用[23]。研究表明，雌激素能够促进颗粒细胞的增殖，抑制颗粒细胞的凋亡[24]。在山羊中，雌激素的产生能够提高山羊卵泡颗粒细胞的活性[25]。干扰RBL2后雌激素水平明显上升，同时CYP19A1基因的表达量上升，表明干扰RBL2能够促进雌激素的合成，进而对绵羊卵泡颗粒细胞增殖产生影响。卵泡发育后期，促黄体素会导致雌激素水平下降、颗粒黄体细胞分泌的孕激素水平升高，STAR、CYP11A1、3β-HSD基因的表达水平较高[26]。高浓度的孕激素能够促进子宫内膜癌细胞[27]和卵巢癌细胞[28]的凋亡，抑制细胞增殖。孕激素可能通过FOXO通路对细胞增殖和凋亡产生影响。与对照组相比，干扰RBL2后孕激素的水平显著下降，3β-HSD和STAR基因表达量显著下降，CYP11A1基因的表达量差异不显著，但有下降的趋势。因此，低浓度的孕激素可能对绵羊卵泡颗粒细胞的增殖有促进作用。

RBL2/p130蛋白属于RB蛋白家族成员，该家族成员还包括RB1/p105和RBL1/p107蛋白，它们都能够影响细胞周期，并且可影响细胞的生长发育[18]。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是RBL2/p130磷酸化的主要激酶，同时RBL2/p130能够与E2F4相结合形成异二聚体，对下游基因的转录产生影响[29-30]。FOXO3a是FOXO家族中一个重要的转录因子，不同动物卵泡发育过程中均有FOXO家族基因的表达。FOXO信号通路在细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。降低FOXO3a的表达量能够促进鹅卵泡颗粒细胞增殖[31]，FOXO3a也可参与 猪[32]、大 鼠[33]、耗 牛[34]、鸡[35]卵 泡 颗 粒 细 胞 的 生 长发育。CHEN等[19]研究表明，下调RBL2能够激活FOXO通路，促使FOXO表达量明显上升，而下游的P21和P27基因的表达量显著降低，可影响细胞周期并促进细胞增殖。CCND1是细胞增殖的标志性 基 因[36]。LU等[37]和WANG等[38]研 究 表 明，miR-17-92簇可能通过靶向RBL2影响小鼠胚胎肺上皮细胞的增生和脂肪细胞的分化。干扰RBL2后，FOXO3a和CCND1基因的表达量显著上升，细胞周期相关基因P21和P27基因的表达量显著下降。因此，干扰RBL2可能对细胞增殖有促进作用。

BCL-2家 族 中有抗凋亡因子BCL-2、BAX和BAD。相关研究表明，BCL-2/BAX的值对细胞凋 亡 非 常 重 要[39-41]。GUO等[42]和LI等[43]研 究 表 明，BCL-2/BAX的值升高时，对细胞凋亡有抑制作用；反之，对细胞凋亡有促进作用。干扰RBL2后，BCL-2基因的相对表达量升高，BAX和BAD基因的相对表达量降低，而BCL-2/BAX的值显著上升。同时，Caspase基因家族也与细胞凋亡密切相关。在干扰RBL2后，Caspase3的表达量显著下降。上述研究表明，干扰RBL2可能对绵羊卵泡颗粒细胞凋亡有抑制作用。

活性氧（ROS）对维持细胞正常内环境的稳态具有重要作用。氧化应激时，细胞中会产生大量ROS，对细胞造成严重影响。而过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶2（SOD2）作为抗氧化酶能够参与氧化应激反应，修复细胞中氧化应激带来的损伤。大量研究表明，在大鼠[44]、小鼠[45]、绵羊[46]的睾丸间质细胞中，通过不同途径调控氧化应激均有可能影响细胞周期，对细胞的增殖和凋亡产生影响。本试验干扰RBL2后检测抗氧化相关基因CAT和SOD2，结果显示，CAT和SOD2的表达量显著上升。MC-LR能够诱导颗粒细胞氧化应激，对卵泡的正常发育产生影响，进而影响雌性动物的生殖能力[47]。因此，干扰RBL2可能提高抗氧化酶相关基因的表达来促进绵羊卵泡颗粒细胞的增殖。

综上所述，干扰RBL2可能在细胞周期、细胞凋亡、抗氧化及类固醇类激素合成中对绵羊卵泡颗粒细胞产生影响，进而促进绵羊卵泡颗粒细胞的增殖。