一株异养硝化-好氧反硝化菌株的分离鉴定及其对养殖废水的脱氮效果

陈春秀，马 超，刘 皓，王群山，贾 磊，于燕光，殷小亚，钱 红

(1.天津市水产研究所，天津300221；2.天津市农业发展服务中心，天津 300201 )

近年来，随着我国海水养殖业向集约化现代化的高速发展，产生了大量的养殖废水，同时也带来了严重的环境污染及生态安全等问题。由于水产养殖动物的残料、排泄物、尸体等有机物导致养殖废水中含有大量含氮化合物，不仅危害养殖动物，损害养殖者的经济效益，还会对我们赖以生存的环境及水生态系统造成严重影响及危害，从而制约了我国海水养殖的健康可持续发展。因此，海水养殖废水的净化处理已成为养殖业亟待解决的关键问题。生物脱氮因其经济高效、绿色环保等优点被广泛关注，并应用于养殖废水处理，其中异养硝化-好氧反硝化细菌相比于传统脱氮，不受限于氧气，而且能将氨氮直接转化为氮的气态产物而备受关注，近年来一直是学者研究的热点。

1983年Robertson首次发现并提出异养硝化-好氧反硝化细菌概念，其后不同菌属的异养硝化-好氧反硝化菌被相继从不同环境中分离并鉴定，包括不动杆菌、假单胞菌、黏质沙雷氏菌等。目前，关于异养硝化-好氧反硝化细菌在水产养殖废水处理实际应用方面鲜有报道的研究，大多处于实验室阶段。孙雪梅等从海水中分离出一株异养硝化-好氧反硝化菌2-3属于盐单胞菌() ，在高盐环境中生长，同时具有高效的异养硝化和好氧反硝化能力，能够独立完成脱氮的全部过程。张达娟等从凡纳滨对虾养殖池塘中分离出来的一株施氏假单胞菌()，通过净化模拟养殖水体结果表明此菌株脱氮效果明显。脱氮细菌在水产养殖业上的应用越来越广泛，而异养硝化-好氧反硝化细菌也势必会给规模集约化水产养殖废水处理带来新的希望。因此，筛选出适应有氧高盐水环境，且能高效脱氮的菌株，是海水养殖废水净化的关键。不仅有利于揭示异养硝化-好氧反硝化细菌脱氮机理，还可以为海水养殖废水净化处理等工艺提供菌种。本研究从海水养殖废水处理池中经分离筛选得到1株异养硝化-好氧反硝化菌株，通过形态学和16S rDNA 基因序列分析对其进行了菌种鉴定，并将其接种到实际的半滑舌鳎工厂化养殖废水中，对其实际应用处理效果进行了初步研究。以期对海水养殖废水净化及其相关微生态制剂开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 分别从天津市汉沽区对虾育苗尾水沉淀池塘采集底泥和海水养殖废水处理池中生物填料采集生物膜，用于分离筛选细菌。

1.1.2 培养基及溶液

溴甲基酚蓝(BTB)固体培养基：柠檬酸钠5.0 g，KNO1 g，KHPO1.5 g，KHPO1.5 g，BTB 1mL，MgSO·7HO 0.2 g，盐度为15 ‰的人工海水， BTB 1 mL，琼脂25.0 g，用NaOH调pH值至7.0～7.3。该培养基用于菌株分离和初筛。

异养硝化培养基：NHCl 0.5 g；柠檬酸钠5.66 g；维氏盐溶液50 mL；调pH至7.0。该培养基用于初筛菌株氨氮去除能力测试。

维氏盐溶液：KHPO5.0 g；MgSO·7HO 2.5 g；FeSO·7HO 0.05 g；MnSO·4HO 0.05 g；盐度为15‰的人工海水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 异养硝化-好氧反硝化菌分离纯化 取水样悬液10 mL用无菌水稀释制备成10稀释液，取0.1 mL涂布在BTB固体培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d，将能使BTB培养基由绿变蓝的菌株在已制好的平板培养基上进行划线分离纯化，挑取不同类型的菌落分离纯化3次以上，直至得到单一的菌落为止。镜检验纯并采用甘油保存法-80 ℃保种。

1.2.2 好氧反硝化菌株硝化能力的测定 无菌条件下，将分离纯化的菌株分别接种至装有100 mL液体异养硝化培养基的250 mL锥形瓶中富集培养，28 ℃，120 r/min培养24 h。再将富集后的菌悬液再次分别以1 %的接种量接种至分别装有液体异养硝化培养基的锥形瓶中，于28 ℃恒温，摇床培养24 h后，摇匀后移取10 mL菌液，以8 000 r/min离心，取上清液。检测其中氨氮的浓度。根据氨氮和总氮的去除率，挑选一株高效的脱氮细菌。

1.2.3 菌种鉴定

形态学鉴定：将筛选的一株高效菌株接种于BTB固体培养基上，28 ℃恒温培养24 h，待长出单个菌落后，进行形态学观察、革兰氏染色和电镜扫描。

16S rDNA基因分子鉴定：采用蛋白酶K裂解的方法进行基因组DNA抽提，采用引物8F(5′ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′ -GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行 PCR 扩增。PCR 反应体系：BioLinker 2×Taq Mix 20 μL，上游引物8F和下游引物1492R各1 μL，模板1 μL，补ddHO至40 μL。PCR 程序：94 ℃，3 min ；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s ；72 ℃ 90 s；循环25次；72 ℃，5 min；10 ℃，5 min。高效菌株的扩增产物测序工作由上海微基生物科技有限公司完成，测序结果与NCBI数据库进行同源性比对，并利用 MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

1.2.4 菌株WM2对养殖废水脱氮效果研究 试验所用水样采集自天津汉沽水产养殖废水处理池。经检测，该废水中氨氮浓度为(0.83±0.04)mg/L，硝态氮(0.19±0.02)mg/L，亚硝态氮(0.87±0.05)mg/L。

将养殖废水抽滤后分装到3个250 mL锥形瓶中(三个平行)，按1%接种量介入菌株WM2悬液，接种后将水样至于28 ℃，120 r/min培养箱中48 h，每24 h取50 mL水样测定氨氮、硝态氮、亚硝态氮浓度，测定方法参照海洋监测规范(GB 17378.4-2007)和《水和废水监测分析方法》进行。

1.2.5 数据分析 试验结果用平均值±标准差表示；在统计软件SPSS 20.0中利用单因素方差分析对数据进行分析比较，显著性差异水平参考<0.05。

2 结果与分析

2.1 分离纯化和初筛菌株

利用BTB培养基的显色反应，共分离纯化筛选出5株具有反硝化能力的菌株。然后将5株菌株接入氨氮初始浓度为101 mg/L的异养硝化液体培养基中，培养24 h后检测其中氨氮和总氮的浓度。结果表明(图1)，5组液体培养基中的氨氮都有一定的降解，说明5株菌株均有一定的硝化能力，其中3号菌株处理的液体中氨氮和总氮去除率最高，分别为76.3%和53.5%，图2的结果显示3号菌株并没有亚硝态氮的积累，因此将此菌株作为研究对象，并命名为WM2。

图1 5株菌株在异养硝化液体培养基中培养24 h的总氮和氨氮去除率

图2 5株菌株在异养硝化液体培养基中培养24 h后的亚硝态氮浓度

2.3 菌株鉴定

2.3.1 菌株形态特征 分离的菌株WM2在固体培养基平板上形成的菌落呈现圆形，略微凸起，颜色略黄且透明，边缘规则整齐，表面光滑(图3 a)。通过显色反应表明该菌株为革兰氏阴性菌(图3 b)。经电镜扫描发现，菌株WM2为短杆状，无鞭毛(图3 c)。

图3 菌株WM2的形态特征

2.3.2 菌株16S rDNA基因序列和系统发育 通过扩增和测序，获得菌株WM2的16S rDNA序列大小为1 393 BP，BLAST对比结果表明，菌株WM2与AR-11(GenBANk:NR_116301.1) 的相似度最高为99.282%，在比对结果中挑选与菌株WM2相似性最高的前10位物种构建系统发育树(图4)，结合菌株WM2的形态学，结果表明菌株WM2属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)海生杆菌属()。

图4 基于16S rDNA基因序列同源性构建的菌株WM2的系统发育树

2.4 菌株WM2在海水养殖废水中的脱氮效果

将筛选的菌株WM2应用于实际海水养殖废水中，经菌株WM2处理后的养殖废水中的氨氮、亚硝态氮和硝态氮浓度均有所下降(图5)，其脱氮效果明显，处理48 h后的氨氮、亚硝态氮和硝态氮去除率分别为99.66%、88.77%和89.38%(图6)。

图5 菌株WM2处理不同时间后养殖水体中的氨氮、亚硝态氮、硝态氮的浓度

图6 菌株WM2处理不同时间后养殖水体中的氨氮、亚硝态氮、硝态氮的去除率

3 讨论

海生杆菌属属于海洋螺菌目、海洋螺菌科，最早于1997年由González等发现并鉴定。到目前为止超过18种菌种从各种海洋环境中被分离，且均为革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状，其中大多数菌种的最适生长温度为30 ℃，pH为7～8。对于海生杆菌属的研究多见于海洋芳香烃污染物治理，如Bae等从海洋沉积物中分离一株可以降解苯的海生杆菌菌株ST58-10T，王梦汝等在对海生杆菌属基因组测序数据分析时发现，海生杆菌属普遍具有苯、苯酚和苯甲酸的降解途径。而对于海生杆菌属在脱氮作用方面研究鲜有报道。目前应用异养硝化-好氧反硝化细菌对养殖废水进行净化处理的研究广泛，陈猛等从猪粪水自然曝气池中筛选出菌株ZF2-3，将其应用于养殖废水脱氮结果表明，水体中氨氮、总氮浓度分别降低37.7%、67.4%；康传磊等考察了3株异养硝化-好氧反硝化细菌对圆斑星鲽养殖废水的净化效果，研究表明添加的异养硝化-好氧反硝化细菌可在不添加碳源的情况下实现脱氮功能，有效维护养殖水质，并且对圆斑星鲽无毒害及致病作用。本研究从海水养殖废水处理池中分离筛选的菌株WM2，通过形态学和16S rDNA基因序列分析表明该菌株属于海生杆菌属，且为一株异养硝化-好氧反硝化细菌，具有良好的脱氮性能，尤其是在高盐有氧条件下的养殖废水中脱氮效果显著，普通微生物在高盐度环境下因高渗透压导致其细胞质壁分离抑制其酶活及生长，从而使常规生物处理效果不明显，因此该菌株的发现对海水养殖废水净化具有重大意义，存在巨大开发和应用价值。

在本试验初筛时，液体异养硝化培养基中氯化铵是唯一的氮源，菌株WM2表现出较强的氨氮去除效果，氨氮去除率达到76.3%，且几乎没有亚硝态氮和硝态氮的积累，具有异养硝化-好氧反硝化功能，同时WM2对总氮的去除率为76.3%，因此我们推断部分氨氮被用于菌体细胞物质的合成，其余部分氨氮可能通过羟胺氧化途径直接转化为气态排出反应体系；当用菌株WM2对实际养殖废水进行净化处理时，氮源变成氨氮、硝态氮、亚硝态氮的混合氮源，WM2的脱氮效果显著，处理48 h后的氨氮去除率89.38%、硝态氮去除率88.77%、亚硝态氮去除率99.66%，但其具体脱氮机理还有待研究。碳源同样是好氧反硝化菌脱氮效果主要影响因子之一，不仅为细菌进行生命活动提供能量，还能为其好氧反硝化过程提供电子受体，且有研究表明好氧反硝化菌主要以葡萄糖、丁二酸钠、乙酸钠和柠檬酸钠等为碳源，少数也有以难降解的有机物为碳源，郭超等对一株从污泥中分离出的高效好氧反硝化菌株Y8进行不同碳源脱氮性能时发现丁二酸钠为最佳碳源。除了碳源外，适宜的温度、pH、碳氮比、菌种接种浓度都是异养硝化-好氧反硝化菌脱氮效果的影响因素，而本试验对筛选菌株进行脱氮性能测试时所有培养基均以柠檬酸钠作为唯一碳源且试验条件较为单一，并没有确定WM2最佳脱氮条件，下一步拟对其生理生化特性及脱氮机理进行研究。

4 结论

从对虾育苗尾水沉淀池塘采集底泥和海水养殖废水处理池中生物填料，利用BTB培养共分离纯化筛选出5株具有反硝化能力的菌株。并利用异养硝化液体培养基测试这5株菌株的氨氮去除能力，其中3号菌株氨氮和总氮去除率最高，分别为76.3%和53.5%，并命名为WM2进行下一步研究。

通过形态学鉴定结果表明菌株WM2为革兰氏阴性菌，电镜扫描发现其为短杆状，无鞭毛，菌落呈现圆形，略微凸起，颜色略黄且透明，边缘规则整齐，表面光滑。16S rDNA序列大小为1 393 BP，与strain AR-11(GenBANk:NR_116301.1) 的相似度最高为99.282%。

菌株WM2对实际海水养殖废水处理48 h后氨氮、亚硝态氮和硝态氮去除率分别为99.66%、88.77%和89.38%，其脱氮效果明显。