鱼类中低氧诱导因子表达及功能的研究进展

李 润，王秀利

(大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023)

氧气是所有有氧生物进行生命活动所必需的，因此它也是鱼类在生长发育和代谢过程中不可缺少的物质。对于水生动物来说，缺氧的现象越来越容易发生，这也可能是近年来全球气候变暖或水体富营养化等因素造成的结果。而在水产养殖行业缺氧的现象更是频频出现，随着目前水产养殖量的扩大，养殖过程中高密度养殖和气温升高都会造成水体缺氧，所以对低氧的研究也就显得尤为重要。

异养生物的新陈代谢很大程度依赖于氧气，而在低氧条件下，低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)是机体对氧气浓度产生应答等相关生理反应的关键调控因子。低氧诱导因子HIF作为异源二聚体，由与氧气调节有关的α亚基和β亚基组成，因为α亚基这一功能单位的差异性，所以在哺乳动物中已经发现了三种不同的HIF(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)，而在鱼类研究中除了前三种还发现了第四种HIF(HIF-4)，且HIF-4α蛋白与HIF-3α蛋白的关系较为密切，但是HIF-3α与HIF-4α的研究还是较少，一直以来大部分研究都围绕HIF-1α和HIF-2α展开。

低氧诱导因子HIF作为低氧条件下的重要调控因子，主要通过调节内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮素1(endothelin-1,ET-1)、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)等基因的表达，来调节机体在低氧环境中的适应性，因此HIF信号通路也成为低氧研究中的主要信号通路。而在低氧条件下参与调控的还有哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路(mammalian target of rapamycin,mTOR)和非折叠蛋白反应途径等，这些通路通过转录或抑制的方式来调节机体对氧气的感受，而这些调控会直接涉及到机体的能量代谢、生长发育和细胞凋亡等，因此鱼类对低氧条件产生应答的分子机制是十分复杂的。本文通过对低氧诱导因子在鱼类中的功能和表达进行综述，为今后鱼类低氧方面的研究提供思路。

1 HIF-1α和HIF-2α的结构与功能

鱼类中低氧诱导因子的结构与功能和哺乳动物的类似，且哺乳动物中对低氧诱导因子的研究更为深入，所以这也为鱼类低氧诱导因子的研究提供了参考。HIF-1α和HIF-2α的发现分别是Semenza等人在低氧条件下处理肝细胞癌株Hep3B和Tian等人在研究内皮细胞时所发现。到目前为止研究发现HIF-1α在低氧条件下参与了150余种基因的表达与调控，如促红细胞生成素基因、血管内皮生长因子基因和糖酵解基因等，而HIF-2α的结构与HIF-1α相似，功能上也具有相似性，所以这两个蛋白的研究在鱼类中也逐渐深入。现如今已在部分鱼类中进行了-1α基因和-2α基因的克隆与表达，并通过转录组学对HIF通路的调控机制进行研究。

在低氧条件下HIF-1α会在细胞核中表达，而在常氧条件下，HIF-1α的天冬酰胺残基会被天冬酰羟化酶(factor inhibiting HIF-1,FIH)羟化，并使HIF-1α不能与环腺苷酸反应元件结合蛋白结合(P300/CBP)导致失活；HIF-1α自身的氧气依靠降解结构域( oxygen-dependent degradation domain,ODDD)中的Pro402与Pro564作为特异性脯氨酸位点，被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase,PHD)羟基化，之后与肿瘤抑制蛋白pVHL结合，pVHL与elongin B、elongin C、Rbx1、cullin-2组成了VCB-Cul2E3泛素连接酶复合体，然后使HIF-1α降解，这两种途径使鱼类在低氧条件下PHDs和FIH失活，导致HIF-1α蛋白的增多，促进了相关低氧基因的转录，在细胞的增殖和代谢等方面发挥了作用，如图1所示。HIF-2α和HIF-1α通过相同的途径降解，不同的是HIF-2α蛋白在N端和C端分别有一个与DNA结合的结构域和具有转录激活作用的反式活化结构域。

图1 HIF1的激活与调控

虽然HIF-1α和HIF-2α结构功能有相似性，但它们却不能直接互相代替，例如CAR9( carbonic anhydrase 9)、LDHA( lactate dehydrogenaseA)等基因只能被HIF-1α激活，同样，SOX2[SRY ( sex determining region Y)-box2]等只能被HIF-2α激活。而且HIF-1α会在大多数动物的组织器官细胞中表达，而HIF-2α在常氧条件下发现不了表达情况，只有在低氧条件下HIF-2α的表达才会增加，它们之间虽功能相似，但又相互独立，在不同细胞之间的表达差异机制也存在不确定性。因此，它们之间调控表达的关系也一直在被研究。

2 HIF-1α和HIF-2α调控表达的差异性

越来越多的研究表明，HIF-1α和HIF-2α在细胞内的调控差异是较大的，有关HIF中α亚基调控差异见图2。在氧气和α-酮戊二酸存在下，脯氨酰羟化酶(PHD)和HIF抑制因子1(FIH1)羟化并使HIF的α亚基失活。PHD和FIH1活性受到缺氧和某些细胞内代谢物如活性氧ROS、富马酸酯、琥珀酸酯和潜在的2-羟基戊二酸的抑制，从而导致HIF的表达或翻译受到影响。而HIF-1α蛋白的表达是在间歇性缺氧的情况下诱导的，但同时间歇性缺氧又会抑制HIF-2α的表达，沉默调节蛋白会抑制HIF-1α的转录活性，但却会激活HIF-2α的转录活性。这种调控和转录机制表明，HIF-1α和HIF-2α会在某些生理反应中起到相反的作用，它们之间的平衡会对机体的代谢等产生很大的影响。

图2 HIF低氧诱导因子α亚基的调控[6]

例如在小鼠的HIF研究中发现，HIF-1α调节糖酵解，而HIF-2α则调节脂蛋白的代谢，且从小鼠的研究中还发现，HIF-1α对肿瘤的形成起到关键作用，而HIF-2α对肿瘤的生长和发展影响很小。除此之外，在人的生理疾病研究中发现，低氧诱导因子介导的信号通路会调控机体某些组织在氧气低于生理需求的情况下，适应这种低氧环境，并发现了HIF-1α和HIF-2α独特且重叠的靶基因。研究中HIF-1α的表达决定了对低氧的急性适应，HIF-2α和HIF-3α的表达则会在人类内皮的慢性低氧期间开始。在同类型的研究中，HIF-1α的诱导在缺氧发生后就会达到峰值，但HIF-2α的激活则发生的更慢且更持久，它们之间虽具有独特的功能和作用，但同时也会激活部分重叠基因。因此对HIF-1α和HIF-2α是否拥有特定属性展开了研究，发现了HIF-1α和HIF-2α转录因子的固有DNA结合特异性，这就可为同工型的HIF进行独立靶向的转录表达，这些研究都为鱼类低氧条件下HIF的调控机制提供了参考。

鱼类研究中HIF-1α和HIF-2α调控表达也具有部分重叠的作用。例如在低氧条件下对斑马鱼的研究表明，HIF-1α和HIF-2α都会对造血内皮的指示方面产生积极的影响，除此之外，在低氧条件下HIF-1α和HIF-2α同时存在也会促进动物造血干细胞的增加，但从斑马鱼的研究中来看，对HIF-1α和HIF-2α功能双缺失的情况下几乎不产生影响。但这只是斑马鱼研究中HIF与其中一种细胞的调控关系，在其它细胞的调控中它们也会出现抑制的情况。这就说明鱼类中HIF-1α和HIF-2α在机体内的调控机制既存在重叠也存在差异。

3 鱼类中HIF的转录及蛋白特征

在鱼类缺氧研究中，低氧确实会促进基因转录的升高，且反复缺氧或长时间缺氧都会导致HIF mRNA的升高，但在硬骨鱼的研究中，初期的缺氧并未检测到HIF mRNA的升高，因此对于硬骨鱼在低氧条件下HIF信号是否被激活还需进一步研究。除了转录层面的研究，鱼类中HIF蛋白的作用也不仅限于和低氧有关，在部分鱼类的早期发育过程中，HIF蛋白就充当了很重要的角色，例如鲑鱼在卵黄囊时期，HIF-1α的减少会对鱼苗的死亡率产生影响；在斑马鱼和团头鲂中，HIF-1α和HIF-2α在鱼卵中的mRNA也被发现，同时在斑马鱼的发育过程中，HIF-1α在其多个组织中都发生表达，而HIF本就参与调节内皮生长因子等基因的表达，因此这些发现都指向了HIF可能会参与到鱼类的发育过程中。

4 HIF在鱼类组织中的表达分布

低氧诱导因子HIF 在进化中很保守，使得HIF在无脊椎动物到哺乳动物中的表达和调控很相似，并在动物的大多数器官细胞中均表达。而水生动物相比于陆生动物，对水体中溶氧含量的适应性差异较大，例如中华鲟和团头鲂都是对低氧十分敏感的物种，在常氧条件下，检测到中华鲟-2的mRNA非常低，但却高于同等条件下团头鲂的-1浓度。HIF的表达是外部环境因素和内部相关基因等共同作用的结果，对-1克隆和鉴定的鱼有青海湖裸鲤()、俄罗斯鲟()、舌齿鲈()、细须石首鱼()等；对-1和-2都克隆和鉴定的有细须石首鱼()、虹鳟()、斑马鱼()、草鱼()等，其中在草鱼和斑马鱼中还发现了-3α，这三种HIF在鱼类组织中表达广泛，在肝脏、鳃、脑、心脏、性腺、眼睛、肌肉等组织器官中均有表达，但这三种不同的HIF在每种鱼的同一组织中表达水平存在差异。在斑马鱼的胚胎发育模式研究中，HIF-1α在胚胎发育的后期表达很明显，而HIF-2α则会被限制在脊索、体节和血管等组织中，并且HIF-1α和HIF-2α在某些部位表达出现了重叠，有些部位则出现了互相抑制的现象，在脊索等组织中，当HIF-2α开始表达的时候，HIF-1α就开始停止表达了，这可能就和HIF参与了鱼类生长发育有很大的关联。

低氧环境的时间长短是否会对鱼类产生不同的影响，有研究者则同时在急性低氧和长期低氧这两种条件下来研究HIF-1α和HIF-2α的表达。细须石首鱼在这两种情况下，HIF-1α和HIF-2α的表达都明显增高，且在脑和性腺中的表达量高于心脏、肝脏和肌肉组织，而虹鳟鱼在急性低氧条件下HIF-1α的表达水平维持了恒定，这种结果表明，HIF的调控和表达可能还与鱼的种类有密切的关系。

5 HIF在鱼类生理反应中的作用

鱼类研究表明，HIF通路会影响相关靶基因的表达、免疫反应、炎症反应以及细胞的形成等生命活动。斑马鱼作为模式动物，是科学研究中主要的研究对象。现如今已对斑马鱼HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α与低氧耐受的能力进行了关联分析，发现HIF-1α和HIF-2α都可以对血管内皮细胞产生积极的影响，从而正向调节造血干细胞的形成，来应对低氧环境；同时发现HIF-3α的缺失也降低了斑马鱼对低氧环境的耐受性，并通过红系特异核蛋白转录因子(GATA1)调节红细胞的数量来调控低氧耐受性。HIF-1α相比于HIF-2α和HIF-3α在斑马鱼中研究更广，除了验证HIF-1α与耐低氧的关系，还发现了HIF-1α对威尔逊氏病的影响，HIF-1α信号通路的调节可改善斑马鱼脂肪肝的变形，同时也可以降低威尔逊氏病中铜毒性的积累。斑马鱼中HIF通路的调控与低氧条件以及体内多种细胞、相关基因和疾病都有关联性的影响。

在研究低氧条件与HIF通路的关系同时，一些研究者也开始研究如何使鱼耐受低氧，比如在罗非鱼的研究中，通过投喂枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以提升罗非鱼血液中血细胞的比容，使红细胞、血红蛋白和白细胞增加，并刺激鱼肝中热休克蛋白和低氧诱导因子HIF-1α的表达增加，提升罗非鱼的耐低氧性。黄芩提取物对褐蓝子鱼HIF-1α的表达上调并同时具有消炎的功效。乳酸乳球菌对鲤HIF诱导的基因激活性更强。这些研究也为我们在提高鱼类耐低氧方面提供了新的思路。

6 结语

目前对鱼类耐低氧的研究已经越来越广泛，有关鱼类对低氧环境的适应策略、低氧信号相关基因的表达以及对低氧环境的适应机制的研究都有了一定的进展，例如通过雌核发育的方法来研究雌性钝嘴鲷比雄性钝嘴鲷耐低氧更强的原因；或鱼病防治研究中发现，鳜鱼HIF-1不仅提高了耐低氧性同时也对该鱼防病毒感染起到很好的作用。但其中具体的基因调控网络以及和某些疾病的引导关系还在逐一研究。虽然HIF相关亚型的克隆和鉴定也在各种鱼类中展开，例如草鱼HIF-4α的克隆和鉴定表明它同样与低氧有关，但它的作用还不是研究得很清楚，因为其它鱼中很少有这个亚型。

在鱼类研究中，大量实验表明HIF与低氧有关，但鱼类中低氧诱导因子在低氧条件下发挥作用的分子机制还尚未完全清楚。因此HIF准确的分子机制是我们继续研究的重点，这也可为今后鱼类大规模养殖以及分子育种提供宝贵的经验。