鸡蛋黄脂质组的高通量鉴定与解析

何虹霄，周春燕，王 艺，翟世英，耿 放，王金秋

(成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106)

0 引 言

鸡蛋的营养价值高，价格相对较低，是“性价比”(营养价格比)最高的食品之一[1].与鸡蛋清相比，鸡蛋黄中的营养物质种类和含量更高.鸡蛋黄中干物质含量约为50%，其干物质主要包括65%～70%的脂质和约30%的蛋白质[2].鸡蛋黄脂类因富含磷脂等功能性脂质被认为具有较高的营养价值.按类别，鸡蛋黄脂质中约含65%甘油酯，28%～30%磷脂，4%～5%胆固醇，以及少量的游离脂肪酸等其他脂质.在脂肪酸组成方面，鸡蛋黄脂质水解后的脂肪酸以棕榈酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)和亚油酸(C18∶2)为主[3].在鸡蛋黄的脂质类别和脂肪酸组成方面，已有诸多研究报道.但对鸡蛋黄脂质的分子种类，即甘油(或其他配体)和脂肪酸的不同组合，当前的研究和报道相对较少.

由于脂质的分子种类呈现多样性，这为脂质分子的鉴定带来了挑战.近年来，随着质谱技术的不断发展，可实现对生物样品中脂质分子种类的高通量鉴定，由此，脂质组概念被提出并得到快速发展.当前，脂质组已广泛应用于食品的研究和检测中.例如，朱玲娇[4]对禽蛋磷脂的组成及其脂肪酸的分布进行了分析研究；李静[5]不仅对不同种类的禽蛋及蛋制品中的胆固醇含量进行了分析测定，还对受精蛋蛋黄中胆固醇含量在孵化期间的变化规律进行了研究.基于液质联用(LC-MS/MS)的脂质组分析流程具有高通量与高准确度的特点，已被应用于畜产食品中脂质的分析.例如，Gu等[6]从牦牛、犏牛和黄牛的里脊肉中鉴定到296种脂质分子，定量分析显示磷脂和酰基肉碱是3个品种牛肉中差异较大的脂质分子类别.但目前尚无关于鸡蛋黄整体的脂质分子种类鉴定和分析报道.基于此，本研究运用脂质组分析技术对鸡蛋黄样品中的脂质分子种类进行鉴定和相对定量分析，从而实现对鸡蛋黄脂质的详细了解，为进一步优化鸡蛋贮藏保鲜方案，加工工艺条件，以及开发高附加值蛋制品提供重要参考.

1 材料与方法

1.1 仪 器

Shimadzu CBM-30A型超高效液相色谱仪(上海岛津实验器材有限公司)，Qtrap-4500型质谱仪器(上海SCIEX分析仪器贸易有限公司)，Agilent 7890B型气相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，HH-S6型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)，JA2003型分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司).

1.2 材 料

新鲜鸡蛋，由四川圣迪乐村生态食品股份有限公司家禽养殖场提供；甲醇、甲酸铵、甲基叔丁基醚、乙腈、氯仿、醋酸、正己烷，均为色谱纯，购自美国默克公司；甲苯、石油醚、浓硫酸，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；混合脂肪酸甲酯标准品，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；溶血磷脂酰胆碱(12∶0，LPC)、神经酰胺(d18∶1/4∶0，Cer)、磷脂酰胆碱(13∶0/13∶0，PC)、甘油二酯(12∶0/12∶0，DG)、甘油三酯(17∶0/17∶0/17∶0，TG)，购自阿凡提极地脂质公司.

1.3 方 法

1.3.1 鸡蛋黄样品的制备

用蛋黄分离器分出鸡蛋黄，将收集的鸡蛋黄在滤纸上滚动以去除吸附在蛋黄膜上的蛋清液和系带，直到能肉眼看到蛋黄膜表面比较干燥为止.用牙签刺破蛋黄膜，然后用烧杯收集流出的蛋黄液.共收集15 枚鸡蛋的蛋黄液，磁力搅拌充分混匀.用移液器吸取蛋黄液并分装至50 mL离心管中，立即用液氮迅速冷冻，然后放入冰箱(-80 ℃)进行超低温保存，用于后续检测分析.

1.3.2 脂质组分析前处理

样品从-80 ℃冰箱中取出，在液氮下手动研磨至粉末状，称取50 mg置2 mL离心管中，并向离心管中加入1 mL脂质提取液(甲基叔丁基醚和甲醇混合物，3∶1，V/V)，并放入钢珠，用球磨机将样品匀浆.取出钢珠，加入500 μL水，涡旋混匀1 min，然后在12 000 ×g、4℃下离心10 min.吸取上层清液500 μL于1.5 mL离心管中，真空浓缩器挥干溶剂至恒重，用100 μL含有0.04%乙酸的乙腈溶液复溶.

1.3.3 液相分离

色谱柱为Thermo C30，2.1 mm×100 mm(内径×柱长)，填料粒径2.6 μm.流动相A为乙腈∶水混合溶液，体积比为60∶40(含0.04%乙酸与5 mmol/L甲酸铵)；流动相B为乙腈∶异丙醇混合溶液，体积比为10∶90(含0.04%乙酸与5 mmol/L甲酸铵).进样量为2 μL.梯度洗脱程序为：0 min，A∶B=80∶20；3 min，A∶B=50∶50；5 min，A∶B=35∶65；9 min，A∶B=25∶75；15.5 min，A∶B=10∶90.流速为0.35 mL/min，柱温45 ℃.

1.3.4 质谱分析

电喷雾离子源温度为550 ℃；质谱电压为5 500 V(正极)或-4 500 V(负极)；帘气压力241.3 kPa；碰撞诱导电离参数设置为中；在三重四极杆中，每个离子对根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测.

1.3.5 脂质分子的定性

基于靶向标准品数据库MWDB，根据检测物质的保留时间、子母离子对信息(50～1 000 m/z)及二级谱数据进行脂质分子的鉴定.

1.3.6 脂质分子的相对定量

基于代谢物的质谱信号强度进行相对定量分析，通过三重四极杆质谱的多反应监测模式进行分析.脂质组分析重复测定3次.

2 结果与分析

2.1 鸡蛋黄中脂质的分子种类

脂肪酸的不同组合可以形成种类丰富的脂质分子.大量研究显示，食品中脂质的分子种类可多达数百上千种.这些不同结构的脂质分子具有不同的特性，因此，若要对食品中的脂质进行系统地了解，需对其脂质分子种类进行鉴定.

脂质组分析结果显示，共从鸡蛋黄样品中鉴定出787种脂质分子.其中，甘油酯及脂肪酸类包括212种TG、55种DG、3种单甘油酯(MG)和37种游离脂肪酸(FFA).磷脂类包括139种PC、122种磷脂酰乙醇胺(PE)、34种LPC、23种溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、14种磷脂酰甘油(PG)、14种磷脂酰丝氨酸(PS)、4种磷脂酸(PA)、4种磷脂酰肌醇(PI)、2种溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、1种溶血磷脂酸(LPA)、1种溶血磷脂酰肌醇(LPI)和1种溶血磷脂酰甘油(LPG)、41种Cer和30种鞘磷脂(SM).其他脂质包括36种酰基肉碱(CAR)、9种胆固醇脂(CE)、2种辅酶Q(COQ)和3种类花生酸(Eicosanoid).

基于鉴定到的脂质分子在质谱中的信号强度，对鸡蛋黄中鉴定到的787种脂质分子进行相对含量分析.结果显示，鸡蛋黄脂质中磷脂的相对含量最高，为64.5%，其中PE和LPE含量最为丰富.鸡蛋黄中甘油酯相对含量为26.7%，主要为TG和DG.FFA相对含量为8.1%，CAR相对含量为0.31%，其他脂质相对含量较少.

2.2 鸡蛋黄中的磷脂

在鉴定到的139种鸡蛋黄PC分子中，相对含量最高的3种PC分子为PC(18∶0/22∶5)、PC(16∶1/22∶2)和PC(22∶4/14∶1)，分别占鸡蛋黄总PC的18.1%、13.0%和6.1%(见图1(A)).在34种LPC分子中，LPC(18∶1/0∶0)占鸡蛋黄中所有LPC的61.8%(见图1(B))，表明LPC类别中，脂质分子的相对含量比较集中.此外，在丰度前十的PC分子和丰度前五的LPC分子中，PC(18∶0/22∶5)、PC(22∶4/14∶1)、PC(18∶1/22∶6)、PC(16∶1/22∶6)、LPC(20∶4/0∶0)和LPC(22∶6/0∶0)均含有二十二碳六烯酸(C22∶6，DHA)、二十二碳五烯酸(C22∶5，DPA)和二十碳四烯酸(C20∶4，ARA)等长链多不饱和脂肪酸，表明鸡蛋黄PC和LPC具有较高的营养价值.

图1 鸡蛋黄中的主要PC和LPC

鸡蛋黄中PE和LPE分子相对含量亦具有类似特点.PE分子的相对含量相对分散，前3种PE分子合计占比为30.9%(见图2(A))；而LPE分子的相对含量相对集中，前3种LPE分子合计占比达到85.8%(见图2(B)).相对PC和LPC，在丰度靠前的PE和LPE分子中含有DHA和ARA的分子种类较少，仅PE(18∶0/22∶6)、LPE(0∶0/22∶6)和LPE(0∶0/20∶4)3种分子.这在一定程度上表明，鸡蛋黄中PE的营养价值可能弱于PC.

图2 鸡蛋黄中的主要PE和LPE

2.3 鸡蛋黄中的SM和Cer

SM是鞘氨醇的氨基以酰胺键与1分子脂肪酸相连形成的，含有鞘氨醇或二氢鞘氨醇，但不含甘油的磷脂.蛋黄中鉴定到30种SM和41种Cer.其中，SM(d18∶1/22∶0)、1-磷酸神经氨酸(d18∶1/16∶0,CerP)和Cer(d18∶1/24∶1)3种分子丰度最高，占鸡蛋黄总SM和Cer的15.1%、10.8%和7.8%(见图3).丰度前10的SM和Cer分子中，不饱和双键的数量为1～3个，与PC(不饱和双键的数量为1～7个)和PE(不饱和双键的数量为0～6个)相比明显较少，表明鸡蛋黄中SM和Cer分子的饱和度相对较高.

图3 鸡蛋黄中的主要SM和Cer

2.4 鸡蛋黄中的甘油酯

脂肪酸甘油酯根据甘油骨架上结合的脂肪酸数目不同进行分类，分为TG、DG和MG.在鸡蛋黄脂质中检测出212种TG、55种DG和3种MG.鸡蛋黄中TG的种类丰富，脂肪酸的双键数、双键位置，以及不同脂肪酸的组合等形成了TG的多样性.而鸡蛋黄脂质中的DG种类相对较少.

在所鉴定到的甘油酯中，DG(18∶1/18∶1/0∶0)、TG(14∶0/18∶1/20∶1)和TG(16∶0/16∶1/20∶1)的相对含量最高，分别占蛋黄总甘油酯的15.6%、13.1%和8.2%(见图4).这3种甘油酯均含有2个单不饱和脂肪酸(MUFA)，显示出鸡蛋黄甘油酯较高的不饱和度.在相对含量前10的甘油酯中，TG(18∶1/18∶1/18∶2)的不饱和度最高，其占鸡蛋黄总甘油酯的3.5%.

图4 鸡蛋黄中的主要甘油酯

2.5 鸡蛋黄中的FFA

在鸡蛋黄脂质中检测出37种FFA.其中，油酸(C18∶1)的占比最高，达到鸡蛋黄总FFA的38.0%(见图5)，在鸡蛋黄FFA中，鉴定到6种链长较短的(C15及以下)脂肪酸，这些脂肪酸在先前基于GC的鸡蛋黄总脂肪酸分析中未被鉴定到.这可能是由于检测方法不同，脂质组分析所采用的LC-MS/MS灵敏度显著高于鸡蛋黄脂肪酸分析所采用的GC.

图5 鸡蛋黄中的主要FFA

鸡蛋黄FFA中，饱和脂肪酸(SFA)共12种，占鸡蛋黄FFA的19.8%；MUFA共9种，占40.4%；多不饱和脂肪酸(PUFA)共16种，占39.8%.鸡蛋黄FFA中PUFA占比显著高于鸡蛋黄总脂肪酸.详细地，FFA中ARA(C20∶4)、DHA(C22∶6)和DPA(C22∶5)的相对占比，均显著高于已有报道的鸡蛋黄总脂肪酸.这些结果显示出鸡蛋黄FFA的整体不饱和度更高.

2.6 鸡蛋黄中的CAR

本次实验在鸡蛋黄脂质中检测到36种CAR.其中，油酰基肉碱(Oleyl-carnitine)和戊二酰基肉碱(Glutaconyl-carnitine)占比最高，两者合计约占鸡蛋黄总CAR的50%(见图6).按照链长划分，鸡蛋黄CAR中短链CAR有8种(C2～C5)、中链CAR有13种(C6～C12)和长链CAR有15种(C13以上).

图6 鸡蛋黄中的主要CAR

2.7 鸡蛋黄中的DHA和二十碳五烯酸(EPA)

在鸡蛋黄TG和磷脂中鉴定出29种含有DHA的脂质分子，13种含有EPA的脂质分子.DHA主要以磷脂的形式存在于鸡蛋黄中，其中48.7%为PE-DHA，39.0%为PC-DHA和11.2%为LPE-DHA，而TG-DHA和DG-DHA仅占0.74%.EPA亦具有相似的规律，79.2%为PC-EPA，20.2%为PE-EPA，0.45%为LPE-EPA，仅0.15%为TG-EPA.DHA和EPA的营养功效已经被深入研究和广泛认可.鸡蛋黄中DHA和EPA主要存在于磷脂中，表明鸡蛋黄磷脂具有优异的营养价值.

3 讨 论

3.1 脂质组分析的定量准确性

值得注意的是，不同类型脂质在离子化效率与碎裂难易等方面具有显著的不同，这使得不同脂质类别的质谱信号响应强度具有较大差异.例如，检测到的鸡蛋黄PE含量高于PC，可能的原因是PE和PC分子中sn-3位上的极性头部基团存在差异，导致PE在质谱检测中离子化效率或信号响应高于PC.因此，基于质谱信号强度进行跨类别的相对含量计算和对比将产生较大误差.基于此，需针对每个脂质类别分别开展定量分析.

3.2 鸡蛋黄脂质分子与鸡胚发育

在鸡胚发育过程中，TG和DG的吸收需要跨越绒毛尿囊膜，在跨膜过程中，被水解为甘油和FFA.其中，部分FFA参与鸡胚发育的能量供给；另一部分脂肪酸重新与甘油组装形成甘油酯，进而参与细胞膜的构建.在贮藏过程中，鸡蛋黄中少量的TG和DG在鸡蛋黄内源脂肪酶的作用下被水解，产生FFA，这一过程被认为是鸡蛋黄自身抑制脂质氧化的一种潜在机制[7].

鸡蛋黄中的FFA在鸡胚发育能量供给方面具有天然优势，因为他们可以更快地被转运至鸡胚中并直接通过β-氧化提供能量.因此，鸡蛋黄中保持一定含量的FFA，可能是为鸡胚发育的启动做准备.此外，相对于TG和磷脂，FFA可以直接与自由基等反应，从而为鸡胚和鸡蛋黄脂质提供抗氧化的屏障.这可能是FFA中PUFA占比相对更高的潜在原因.

CAR是肉碱与脂肪酸结合形成的一类代谢物，是脂肪酸参与β-氧化的中间物质.在脂酰辅酶A合成酶的催化下，脂肪酸首先被活化为脂酰辅酶A，长链脂酰辅酶A需要进一步与肉碱形成CAR，以跨越线粒体内膜进入线粒体基质，从而参与β氧化.由此，推测鸡蛋黄中微量的CAR，对保证鸡胚发育启动时的快速能量供给具有重要作用.

3.3 鸡蛋黄磷脂分子与蛋黄营养特性

膳食中高比例的磷脂有利于食物脂质在小肠中形成平均粒径更小的球形胶束[8]，从而影响人体对脂质的消化和吸收.此外，鸡蛋黄中含有丰富的SM和Cer.作为重要的结构脂质，SM和Cer主要位于细胞膜、脂蛋白和其他富含脂质的组织结构上，对维持细胞膜的完整性，以及脂筏的形成至关重要.同时，SM和Cer广泛参与细胞分化、增殖和凋亡等重要生理过程，并在细胞代谢和信号转导、细胞生长分化、细胞凋亡调节、机体衰老和肿瘤免疫等方面发挥着重要作用.此外，SM和Cer还是合成一系列重要生理鞘脂的通用前体.因此，膳食SM和Cer具有诸多健康功效作用，不仅参与细胞膜的形成并维护其流动性，还能防止脂质代谢异常、发挥抗氧化与抗炎作用[9].已有研究表明，膳食SM及其代谢产物可以剂量依赖性地抑制胆固醇、TG和脂肪酸的吸收，并可显著改善动物血浆与肝脏的胆固醇和TG代谢[10].此外，膳食SM有利于肠道微生物群和胃肠道免疫的稳态平衡，动物实验和临床研究已证实牛奶SM具有较好的降血脂作用[11].

4 结 论

本研究运用LC-MS/MS对鸡蛋黄中的脂质分子进行了鉴定和定量分析，共鉴定到787种脂质分子.相对定量分析显示，PC(18∶0/22∶5)、LPC(18∶1/0∶0)、PE(P-18∶0/18∶0)、LPE(0∶0/18∶0)、SM(d18∶1/22∶0)、DG(18∶1/18∶1/0∶0)、TG(14∶0/18∶1/20∶1)、油酸(C18∶1)和油酰基肉碱(Oleyl-carnitine)分别是各自脂质类别中的代表性脂质分子.此外，统计显示，DHA和EPA等功能活性脂肪酸主要存在于鸡蛋黄磷脂中.本研究提供了鸡蛋黄脂质分子种类的详细信息，为进一步探究鸡蛋黄脂质营养功能和加工特性等提供了重要信息和研究方向.