基于Nrf2通路研究通腑养髓方调控Wilson病模型TX小鼠神经细胞铁死亡的机制

李东昇，程 楠，董健健，徐陈陈，耿 昊，高曼莉

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease, WD)是一种由ATP7B基因突变导致的常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病，是神经遗传病领域重点防治的疾病[1]。前期临床研究[2]发现，脑型WD患者(尤其是出现严重运动障碍和病程较长的难治性脑型WD患者)常规驱铜治疗的疗效差，病情康复缓慢，生活质量和学习、工作能力明显下降，严重者甚至危及生命。因此，研究WD神经细胞的损伤机制及治疗策略对改善脑型WD患者的病情和预后有重要意义。

基于WD诊疗的临床需求，安徽中医药大学神经病学研究所根据脑型WD患者的中医辨证研究结果，创用通腑养髓方治疗脑型WD患者获得显著疗效[3]。实验研究[4-6]发现，通腑养髓方可调控凋亡、自噬相关信号通路，起到改善突触功能障碍，减轻神经细胞损伤的治疗效果。此外，已有研究资料证实，除了铜蓄积直接导致神经细胞损伤外，ATP7B基因突变引起铜蓝蛋白(ceruloplasmin, CP)合成障碍和亚铁氧化酶活性减低致细胞内铁稳态失衡是难治性脑型WD神经细胞损伤的重要机制，也是这些患者常规驱铜疗效不佳的主要原因。近年来研究发现，一种铁依赖性非程序性细胞死亡方式(铁死亡)与多种神经遗传变性病的发病关系密切，且与脑型WD的神经细胞损伤机制相契合[7]。近期研究[8]发现，抗核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2- related factor,Nrf2)信号通路是铁死亡的一个重要调控通路，激活该通路能阻断ferrostatin-1等铁死亡诱导剂诱导的铁死亡而具有细胞保护作用，是难治性脑型WD神经细胞损伤的潜在治疗靶点。基于此，本研究基于Nrf2信号通路观察通腑养髓方对WD模型TX小鼠神经细胞铁死亡的干预效应，并探讨通腑养髓方对WD神经细胞损伤的保护机制。

1 材料

1.1 实验动物 WD模型TX小鼠种鼠及其正常对照组DL小鼠，均从美国Jackson实验室中心引进，于中国科学院合肥物质研究院SPF级实验动物中心繁殖培育。对每只DL小鼠及TX小鼠均进行基因检测，对DL纯合及TX纯合小鼠分别进行合笼繁殖处理。实验动物使用许可证号：SYXK(皖)2018-005，实验动物合格证号：3198342；本研究经中国科学院合肥物质科学研究院动物伦理委员会批准(编号 IACUC19001)。

1.2 主要试剂和药品 参照安徽中医药大学神经病学研究所研制的通腑养髓方组方[9]，药物组成及剂量：大黄、黄连、莪术、姜黄、芍药各30 g，鱼腥草45 g，泽泻36 g，三七4.5 g，山茱萸40 g。加入蒸馏水 2 000 mL，浸泡 30 min，大火煮沸后加入大黄，再以文火煎30 min，过滤至烧杯中，药渣再加入蒸馏水2 000 mL，重复煎煮过滤。将2次药液合并，文火浓缩至1 500 mL(含生药0.184 g/mL)，冷却后倒入棕色瓶内，并于4 ℃冰箱保存备用。抗TfR抗体(ab185550)、抗谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)抗体(ab125066)、Nrf2抗体(ab62352)、抗铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH1)抗体(ab183781)、抗血红素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO1)抗体(ab52947)、抗醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)抗体(ab80588)：英国Abcam公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器与设备 CK2型荧光倒置相差显微镜：日本Olympus公司；XTZ-D型解剖显微镜：上海光学仪器一厂；BioTek Epoch2型全波长酶标仪：美国Biotek公司；NexION 350D型电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)仪：美国PerkinElmer公司；Fine DO X6 型全自动化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司；TGL-16型台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验仪器开发有限公司。

2 方法

2.1 实验分组 按照文献[9]方法复制动物模型和给药。以DL小鼠为正常对照组(n=30，9.0 g/L氯化钠注射液)；将TX小鼠(n=60)随机分为2组：模型组(n=30，9.0 g/L氯化钠注射液)、通腑养髓方组(n=30，20 g/kg通腑养髓方溶液)。将各组小鼠适应性饲养3 d后，每日同一时间段给予药物或9.0 g/L氯化钠注射液灌胃，连续30 d，给药结束后，使用1%戊巴比妥钠麻醉后处死各组小鼠，完整分离小鼠脑组织。

2.2 ICP-MS法检测各组小鼠脑内铜、铁微量元素含量 样品消化分解：根据实验分组收集各组脑组织(n=6)，每管加入1 mL含95%的浓硝酸，100 ℃金属浴60 min，直至管内组织完全消化分解，管内液体呈澄清透明即可，4 ℃放置待测。建立标准曲线：使用调谐液调整射频功率、气体流量、标准度、扫描时间和次数等仪器参数。稀释标准曲线溶液，浓度由低到高，空白管为双蒸水，每管复测3次，根据空白管和对照管数值，建立标准曲线。上机检测：稀释各组样品，依次上机检测(复测3次)，并做好分组标记，将所得数值代入建好的标准曲线，根据公式、样品质量和样品稀释倍数计算出样品中铜、铁微量元素的含量。

2.3 免疫荧光技术检测TX小鼠脑内TfR表达水平 使用冰冻切片机对小鼠脑组织进行切片，选择最大横截面，厚度为35 mm，然后将脑片放置于盛有PBS的24孔板中，4 ℃保存。取脑片放置于反应皿中，0.3% Triton X-100室温反应15 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤，山羊血清原液37 ℃反应30 min，加入抗TfR抗体，4 ℃过夜，PBS洗涤，加入二抗反应30 min，PBS洗涤，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色细胞核，贴片，晾干，封片，曝光。荧光显微镜下TfR阳性呈现为红色，采集图像后经Image J软件进行定量分析。

2.4 TX小鼠脑组织中SOD活性、MDA含量测定 用硫代巴比妥酸法测定脑组织匀浆中MDA水平，可溶性噻唑盐(WST-8)法测定脑组织匀浆中SOD活力。

2.5 透射电子显微镜下观察线粒体结构 使用冰冻切片机对小鼠脑组织进行切片，加入1 mL电子显微镜固定液，室温固定2 h，再转移至4 ℃冰箱过夜。经脱水、干燥、粘样后通过透射电子显微镜观察细胞内线粒体结构。

2.6 Fluoro-Jade B(FJB)染色观察小鼠神经细胞损伤程度 使用冰冻切片机对小鼠脑组织进行切片，经过浸泡、反应、漂洗后均匀滴加0.000 4% FJB染液，处理后浸泡在荧光显微镜下。变性神经细胞在镜下会呈现绿色荧光，采集图像后经Image J软件进行定量分析。

2.7 Western blot法检测TX小鼠脑铁死亡及Nrf2通路相关蛋白(GPX4、Nrf2、FTH1、HO-1、NQO1 )表达水平 各组取脑组织100 mg切碎，加入裂解液和蛋白酶抑制剂混合，用研磨机研磨至无絮状沉淀，静置30 min后离心，取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度，加适量的蛋白上样缓冲液，再通过电泳、转膜、封闭、一抗过夜，二抗孵育2 h，显影剂中浸泡，显影后用Image J软件采集图像并分析蛋白条带的灰度值。

3 结果

3.1 通腑养髓方对TX小鼠脑内铜、铁微量元素含量的影响 与正常对照组比较，模型组TX小鼠脑内铜、铁含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，通腑养髓方组TX小鼠脑内铁含量显著降低(P<0.05)。见图1。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.通腑养髓方组；

3.2 3组小鼠TfR表达水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠TfR表达水平显著增加(P<0.05)；与模型组比较，通腑养髓方组TfR表达水平显著减少(P<0.05)。见图2。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.通腑养髓方组；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.3 3组小鼠脑内SOD活性、MDA含量比较 与正常对照组比较，模型组小鼠脑内SOD活性显著下降(P<0.05)，MDA含量显著上升(P<0.05)；与模型组比较，通腑养髓方组小鼠脑内SOD活性显著上升(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。见图3。

3.4 透射电子显微镜观察各组小鼠脑组织细胞线粒体形态 正常对照组小鼠脑组织细胞线粒体结构正常；模型组小鼠脑组织细胞线粒体膜皱缩，嵴数量减少或消失，出现空泡；通腑养髓方组与模型组比较，线粒体膜平滑，嵴数量增加，损伤程度减轻。见图4。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.通腑养髓方组；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.5 3组小鼠脑皮质神经细胞损伤程度比较 模型组小鼠脑皮质神经细胞损伤程度较正常对照组显著增加(P<0.05)；通腑养髓方组脑皮质神经细胞损伤程度较模型组显著减少(P<0.05)。见图5。

3.6 3组小鼠脑内GPX4表达水平比较 与正常对照组比较，模型组GPX4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，通腑养髓方组GPX4蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图6。

3.7 3组小鼠脑内Nrf2通路相关蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，模型组Nrf2、FTH1、HO1、NQO1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，通腑养髓方组Nrf2、FTH1、HO1、NQO1蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。见图7。

图4 透射电子显微镜观察各组小鼠脑组织细胞线粒体形态(3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，1×4 000倍，1×8 000倍)

注：A.正常对照组；B.模型组；C.通腑养髓方组；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：A.正常对照组；B.模型组；C.通腑养髓方组；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：A.正常对照组；B.模型组；C.通腑养髓方组；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

铁死亡是Dixon[7]在2012年发现的一种程序性细胞死亡方式，不依赖于经典细胞凋亡通路的调控，不受凋亡、坏死和自噬的影响，其本质是铁离子依赖的脂质过氧化产物超量蓄积引起氧化损伤，最终导致细胞死亡[10]。近期一项应用免疫荧光染色检测神经细胞铁死亡的研究[11]发现，发生铁死亡的神经细胞TfR表达水平增加、MDA水平升高，提示这两个指标是反映神经细胞铁死亡的特异性指标。另有研究[12]发现，GPX4失活可诱导细胞发生铁死亡,是反映铁死亡的重要指标。本研究发现，WD模型TX小鼠体内铜、铁等微量元素高于正常对照组，证明其脑组织内不但存在铜的蓄积，还存在铁的异常沉积。免疫荧光检测结果显示，TX小鼠脑组织的TfR含量明显高于正常对照组，且TX小鼠脑组织的SOD活性显著下降，MDA水平显著升高，GPX4蛋白表达水平显著降低。透射电子显微镜观察结果显示，TX小鼠脑组织线粒体出现线粒体膜皱缩、嵴数量减少或消失、空泡产生等典型的铁死亡形态。因此，本研究首次发现WD模型TX小鼠脑内存在铁死亡效应。

本课题组前期根据中医“毒损络脉”理论，将WD分为毒伏肝络期、毒损肝络期、肝络瘀阻期、毒邪逆传期4个中医病机分期，以及痰湿阻络、肝胆湿热、痰瘀互结、痰火扰心等12个证型[13]。针对四肢震颤、筋脉拘急、五心烦热盗汗、腰膝酸软、精神异常的部分脑型WD患者，本课题组从中医经典理论“久病致瘀”以及WD患者本身先天禀赋不足的证候特点出发，在肝豆汤的基础上加用三七、山茱萸等活血养髓中药组成“通腑养髓方”，以达到通腑养髓的目的。研究发现，以“通腑养髓”为治疗目的的肝豆汤改良方可通过促进过量铜排出而抑制神经细胞内CytC、Caspase-3和Caspase-9的表达，从而减轻铜过量对神经细胞的损伤作用[14]。肝豆汤改良方通过上调XIAP蛋白及其mRNA的表达水平，下调Caspase-9、Caspase-3蛋白及其mRNA在脑组织中表达水平，减轻铜沉积对神经细胞的氧化应激损伤，从而抑制神经细胞的凋亡[4]。而通腑养髓方可通过调节自噬相关蛋白表达水平，调控LKB1-AMPK信号通路，抑制自噬的发生，从而阻断高铜诱导的神经细胞损伤，并有效发挥神经保护作用[15]。本研究发现，通腑养髓方可降低WD模型TX小鼠脑内铁含量，提高SOD活性，降低MDA水平，减轻神经细胞损伤，上调GPX4蛋白表达水平。结果表明，通腑养髓方可有效减轻体内铜、铁沉积造成的神经细胞损伤，降低体内氧化应激水平，具有保护作用。

Nrf2是抗氧化防御系统的重要转录因子，可以抵抗内部和外部的氧化以及化学刺激[16]。Shind等[17]研究发现，Nrf2通路能改善氧化应激，在抑制铁死亡过程中发挥重要作用，当受到ROS或亲电试剂的刺激时，Nrf2会转移入细胞核内，与靶基因促进区域的抗氧化反应元件(ARE)相互作用，启动下游抗氧化蛋白基因FTH1、HO-1、NQO1等的转录，提高细胞抗氧化能力，维持细胞氧化平衡，从而影响铁死亡[18-19]。本实验结果表明，模型组TX小鼠脑内Nrf2通路相关蛋白Nrf2、FTH1、HO-1及NQO1蛋白表达水平较正常对照组显著降低。通腑养髓方组Nrf2、FTH1、HO-1及NQO1蛋白表达水平较模型组显著升高。结果提示通腑养髓方通过上调Nrf2信号通路相关蛋白表达水平，进一步抑制铁死亡。

综上所述，铁死亡是WD模型TX小鼠神经细胞损伤的重要机制，通腑养髓方可调控Nrf2信号通路，抑制WD模型TX小鼠神经细胞铁死亡，是难治性脑型WD神经细胞损伤的潜在治疗靶点。本研究对Nrf2信号通路相关因子表达水平的变化情况进行了初步探索，为通腑养髓方对Nrf2信号通路的具体调控机制和作用靶点等后续研究提供了理论基础。