唾液细胞因子和菌斑致病菌与老年患者牙周病状态的分析

赵 湘 冯 洁 王潇潇 葛化冰

牙周炎是由牙菌斑微生物引发的、发生在牙周支持组织(牙龈、牙槽骨、牙周膜、牙骨质等)的慢性、感染性疾病，可导致软组织炎症、牙槽骨丢失[1,2]。牙周感染不仅影响口腔健康，还与多种疾病相关，如心脑血管疾病、中风、新生儿早产和低体重等[3]，对患者的生存质量亦会产生负面影响。牙周炎的诊断目前主要依靠影像学技术和牙周检查指数包括牙周探诊深度、临床附着丧失等，具有一定的滞后性[4]，且不适用于大规模的临床筛查。龈沟液来源于龈沟或者牙周袋，能密切反映牙周组织状态的改变，是评估牙周健康或疾病的重要量化指标，但是成年人每天龈沟液的分泌量有限，仅0.5～2.4ml，且在收集的过程中，易受唾液、细菌菌斑等的污染，单个位点采集的龈沟液所包含的信息量有限，不能有效反映全口腔的牙周状况[5]。唾液含有免疫球蛋白、酶、大量电解质及黏蛋白等成分，能有效反映口腔卫生或疾病状况，临床快速筛查具有高灵敏度和高效益的特点[6]。牙菌斑生物膜并不是细菌的简单堆积，而是多种微生物组成的生物群落，多种细菌通过相互交错的信号传导通路协调作用，具有高度的结构性[7]。有研究[8]表明，牙周病患者的菌斑中存在大量的致病微生物。由于牙周病病因不明确，牙周检查依赖于检查者的诊断经验，主观性较强，结合个人病史、影像学检查，往往错过疾病的早期诊断，遗漏潜在病灶。因此，寻找有效、客观且能反映疾病进展的相关指标至关重要。本研究通过检测并比较不同严重程度的牙周炎患者唾液生物标志物以及菌斑生物膜致病菌水平，探究牙周炎患者不同疾病严重程度与生物标志物水平间的关系。

1.资料和方法

1.1 一般资料 选择2018 年6 月-2021 年3 月首都医科大学附属北京口腔医院收治的牙周炎患者126 例作为研究对象，纳入标准：①年龄＞60岁；②符合《牙周病诊疗指南》[9]制定的牙周炎诊断标准；③口内6 个区段至少有一个区段功能牙≥2 颗；④1 年内未进行牙周治疗。排除标准：①既往有糖尿病、自身免疫性疾病、全身性疾病、代谢性骨疾病史；②合并胃癌、食管癌及其他恶性肿瘤、急慢性感染疾病；③近3 个月内曾服用抗生素/ 非甾体类药物；④患有胃静脉曲张、门静脉高压性胃病；⑤临床资料不全。研究组患者平均年龄(67.54±4.16)岁，男性69 例，女性57 例。同期于体检中心进行口腔检查，符合《牙周病诊疗指南》 中牙龈健康者126 例健康者作为对照组，对照组平均年龄(67.83±4.57)岁，男性65 例，女性61 例，研究组患者和对照组患者的年龄、性别均无显著差异。本研究已经本院医学伦理委员会审查通过。

1.2 研究方法

1.2.1 口腔检查 每位研究者均选取6 颗指数牙，即代表性牙位16、11、26、36、31、46，若有缺失则以该牙相邻的牙位代替。每颗牙检查6 个位点：近颊、正中颊、远颊、近舌、正中舌、远舌。采用Hufriedy 刻度探针，测定并记录所有研究对象的附着丧失(attachment loss，AL)、探诊深度(probing depth，PD)、探诊出血(Rleeding on probing，ROP)。研究组患者进行口腔影像学检查，联合口腔检查判别疾病的严重程度。牙周病的严重程度分级，轻度：AL＜3mm，PD≤4mm，影像学检查结果显示牙槽骨吸收＜根长的1/ 3；中、重度牙周病：AL≥3mm，PD＞4mm，影像学检查结果显示牙槽骨吸收≥根长的1/ 3。研究组患者根据牙周病严重程度分为两个亚组，即轻度组和中重度组。

1.2.2 唾液收集及相关指标的检测 禁食禁水1 个小时以上，采用无菌容器收集每个研究对象的唾液(2～5ml)，离心(4℃，8000rpm，5min)后收集上清液，-80℃保存备用。

(1)牙周组织炎症标记物的检测采用酶联免疫吸附(ELISA)检测唾液中白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子-α(Yumor necrosis factor-α，YNF-α)水平。

(2)牙周组织破坏标记物的检测 采用酶联免疫吸附(ELISA)检测唾液中基质金属蛋白酶-8(matrix metalloproteinases-8，MMP-8)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)水平。

1.2.3 菌斑生物膜中定殖细菌的检测 采用无菌龈下刮治器从研究对象牙齿(所有指数牙)的近中颊面处收集龈下菌斑，置于无菌且含有500μL PRS的EP 管中，离心(4℃，13000rpm，5min)，-80℃保存用于DNA 的提取。采用探针法实时荧光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechain reaction，RY-qPCR)检测牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)、福赛坦氏菌(Yannerrellaforsythia,Y.forsythia)和齿垢密螺旋体(Yreponemadenticola,Y.denticola)水平。引物序列见表1。

表1 RY-qPCR的引物序列

1.3 统计学处理 采用统计学软件SPSS 22.0进行统计学分析，计数资料采用率(n,%)表示，组间差异采用卡方检验；符合标准正态分布的计量资料采用()表示，多组组间差异采用方差分析，若P＜0.05，每两组组间差异采用SNK 检验；不符合标准正态分布的计量资料，采用四分位数表示，组间差异采用秩和检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 牙周健康指标的比较 研究组患者的PD值、AL 值以及ROP 阳性率均显著高于对照组，且在研究组中，中重度患者的指标水平较轻度组均有显著提高，见表2。

表2 牙周健康指标的比较

2.2 唾液生物标志物水平的比较 研究组患者较对照组IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平均显著提高，差异具有统计学意义；研究组中，中重度组患者的唾液IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9水平显著高于轻度组患者，差异具有统计学意义，见表3。

表3 唾液生物标志物水平的比较

2.3 菌斑生物膜中三种细菌菌量值比较 研究组患者检测的3 种细菌菌量显著高于对照组，且研究组中中重度牙周病患者，菌斑生物膜检测的细菌量显著高于轻度组患者，差异具有统计学意义，见表4。

表4 菌斑生物膜中三种细菌菌量值比较

2.4 牙周基础治疗后唾液生物标志物水平的比较 经牙周基础治疗后，研究组IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平均显著降低，但是较对照组水平依旧较高，差异具有统计学意义，见表5。

表5 牙周基础治疗后唾液生物标志物水平的比较

3.讨论

牙周病是导致成人失牙的首要原因，采取有效的治疗措施对于患者牙齿的留存、使用周期至关重要。目前，临床针对牙周病的检测，主要集中于龈沟液生物标志物的检测，临床应用尚存在一定的局限性。在本研究中，收集所有研究对象的唾液作为样本，具有非侵入性、客观、便携、易操作的优点[10]，测定了牙周组织炎症标记物IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 以及YNF-α，还测定了牙周组织破坏标记物MMP-8、MMP-9。本研究同时检测了龈下菌斑中的微生物牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)、福赛坦氏菌(Yannerrellaforsythia,Y.forsythia)和齿垢密螺旋体(Yreponemadenticola,Y.denticola)，即“红色复合体(red complex)”，红色复合体是世界牙周病研讨会公认的牙周病主要的致病菌群[11]。

本研究结果表明，牙周炎患者唾液IL-1β、IL-8 水平均显著提高。唾液中含有多种蛋白质，在维持口腔稳定的过程中发挥重要作用。当口腔稳态被打破，宿主在免疫应答的过程中产生了大量的细胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ等。在牙周组织炎症反应开始期间，细胞因子从上皮细胞、巨噬细胞以及结缔组织成纤维细胞和中释放出来[12]。本研究中，中重度牙周炎患者唾液IL-1β、IL-8 水平较轻度牙周炎患者水平升高，其水平与疾病严重程度有关。有研究[13]表明，IL-1β 与牙周炎症参数间存在关联，不仅能反映疾病的严重程度，还能评估患者的治疗效果。

随着牙周炎的进展，牙周组织被破坏，相关的酶如基质金属蛋白酶(MMPs)等被释放到唾液中。有研究[14]表明，随着牙周病变程度的加深，龈沟液中的MMP-8 水平逐渐增加。当牙周炎症开始时，细胞因子释放，MMPs 等相关的酶释放，导致结缔组织胶原蛋白的降解。当结缔组织炎症、降解之后，进一步向龈沟液、牙周袋转移，随后释放到唾液中。有研究[15]表明，MMP-8、MMP-9 在诊断牙周炎时具有很高的诊断价值。本研究中，轻度牙周炎患者的MMP-8、MMP-9 水平较中重度患者低，可反应疾病的严重程度。

本研究中，评估了所有研究对象龈下菌斑中的致病微生物，结果表明，牙周炎患者菌斑中致病微生物水平显著提高。有研究[16]表明，牙周病患者的临床表现与炎症水平、菌斑生物膜均有关联，牙周基础治疗后，龈下菌斑中的红色复合体显著降低。牙周致病菌并不是单独存在，而是在龈下菌斑内共聚，以复合体的形式被发现，协同致病[17]。此外，本研究发现，经牙周基础治疗后，患者唾液中的IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平较治疗前有所降低，但是较健康对照组仍显著升高，推测可能与参与疾病本身有关。本研究中发现，中重度牙周炎患者龈下致病菌数量较轻度患者显著升高，提示致病微生物浓度与疾病严重程度相关。

综上所述，牙周病患者唾液炎症因子标志物及牙周组织破坏标志物水平均显著提高，且与疾病严重程度间存在关联；牙周病患者龈下菌斑中致病菌水平显著提高，且与疾病严重程度相关。本研究为横断面研究，纳入的样本量较小，旨在探究牙周疾病及疾病严重程度患者，唾液生物标志物及菌斑致病菌水平间的差异，为进一步临床研究提供科学依据。