新型根管封闭剂HiFlow 抗菌性能的体外研究

邢 阳 冯立新 徐 颖 王 戈 李芷萱

完美的根管充填材料应该能够对根管系统实现三维空间的、严密的充填，同时将根管与其周围的根尖周组织交通隔断。AH plus 根管封闭剂具有良好的物理性质以及化学性质，已作为“金标准”被广泛应用于热牙胶充填的临床应用中[1]。iRoot SP 根管封闭剂是一种新型的硅酸盐生物陶瓷类根管封闭剂，无铝成分，其理化特性与无机三氧化聚合体(Mineral trioxide aggregate，MYA)相似，具有良好的X 线阻射性、生物相容性、抗菌抑菌性，不存在凝固收缩或者膨胀，粘接性及封闭性良好，已受到临床广泛的重视[2]，但由于其受热后可能产生变性，因此目前对于其在高温状态下的根尖封闭性能及抗菌性尚存在争议[3]。HiFlow 根管封闭剂是一种专门为热牙胶垂直加压充填法而设计的硅酸钙基类预混合根管封闭剂，其主要化学成分与iRoot SP 根管封闭剂相似，仅粒度分布不同，有研究报道称其具有良好的生物相容性、生物活性，易于渗透入牙本质小管内，从而提高其抑菌性能、粘接强度及封闭性能，此外HiFlow 根管封闭剂还具有低收缩性以及X 线阻射性[4]。因此，本实验选择AH plus 根管封闭剂与iRoot SP 根管封闭剂两种经典的根管封闭剂与HiFlow 根管封闭剂进行体外抗菌性能的比较，从而对HiFlow 根管封闭剂的体外抗菌性进行评价。

1.材料与方法

1.1 材料及器械 Endo Sequnce RC Sealer Hi Flow 根管封闭剂(Rrasseler USA，美国)；AH Plus根管封闭剂(Dentsply，瑞士)；iRoot SP 根管封闭剂(Innovative RioceramixInc，Vancouver，加拿大)；复合树脂Z350(3M，美国)；Protaper Universial机用镍钛锉(登士柏，瑞士)；热牙胶充填系统(SybronEndo，美国)；0.06 锥度牙胶尖(北京达雅鼎，中国)；垂直加压器(SybronEndo，美国)；UV 1800 紫外可见分光光度仪(Shimadzu,日本)；粪肠球菌标准菌株AYCC29212(坛墨质检，中国)。

1.2 方法

1.2.1 直接接触实验(direct contact test,DCY)[5]将标准菌粪肠球菌(AYCC29212)制备成浓度为106CFU/ mL 的菌悬液。

取100 个1.5mL 的经无菌处理的离心管，按照选择的根管封闭剂材料的不同，将其共分为5 组，分别为AH Plus 组、iRoot SP 组、Hi Flow 组、阳性对照组、阴性对照组，各组20 个样本。各组封闭剂的使用均严格按照说明书进行，将各组封闭剂分别注入离心管的底部，高度均约1cm，阳性对照组则注入同等高度的凡士林，阴性对照组为无菌空白管。将各组离心管均放置于37℃、相对湿度＞95%的恒温箱中保存备用。

分别于根管封闭剂应用后的20min、1d、7d、14d，每个时间点从各组样本中取出5 个离心管样本，各实验组及阳性对照组的离心管内均被注入10μL 的粪肠球菌菌液，阴性对照组内加入10μL的无菌去离子水。待各组于37℃厌氧培养箱中厌氧培养24h 后，将各组的所得细菌悬液进行浓度稀释，将各浓度的菌液分别取50μL 接种于RHI 琼脂培养基上，置于37℃厌氧培养箱中厌氧下培养24h 后，进行菌落计数，最终结果合算成每毫升CFU，计数结果取均值。

1.2.2 抑菌环实验 取浓度为3×108CFU/ mL的粪肠球菌悬液50μL，以玻璃棒于培养皿上涂开，于37℃厌氧培养箱中厌氧下培养，观察细菌当达到不完全融合生长时，取出培养皿，在同一培养皿上放置带有3 个圆形镂空的滤纸，镂空直径均为5mm，镂空之间保持一定间隔。将3 个镂空分别标记为A、R、C 三组，分别涂布AH Plus 根管封闭剂、iRoot SP 根管封闭剂、Hi Flow 根管封闭剂，另放置一个直径5mm 含有蒸馏水的滤纸作为D 组，每组设置5 个RHI 培养皿。将各组培养皿置于37℃、100%湿度的厌氧培养箱中厌氧培养，分别于1d、3d、7d 时取出培养皿，测量各组的抑菌环直径，每组重复测量3 次，结果取均值记录。

1.2.3 粪肠球菌感染根管模型实验(infected root canal model，IRCM)

(1)离体牙的采集与处理：收集因牙周炎或正畸治疗需要而拔除的单直根管恒牙140 颗，纳入标准：①牙齿发育形态正常，牙根完好，根尖孔发育完全，无龋坏，未经过牙髓治疗，显微镜下观察未见隐裂及外吸收；②X-ray 片显示根管均为单根管恒牙，不存在根管内吸收；③牙根长度正常，釉牙骨质界距离根尖超过11mm；④根管通畅，无钙化；⑤经本院伦理委员会批准，且患者均知情同意。排除标准：①根尖孔不完整，已有吸收或破坏；②为多根管或根管系统存在解剖变异。将所拔除的牙齿流水冲洗干净后，以龈下刮治器刮除牙根表面的牙周膜、肉芽及牙石，再以流水冲洗干净后将离体牙置于0.9%生理盐水中，4℃冰箱冷藏备用。

(2)根管预备：以金刚砂车针沿釉牙骨质界将离体牙进行截冠。冠向下法进行根管预备，将预备好的离体牙样本浸泡于去离子水中，进行高温高压灭菌后备用。

(3)粪肠球菌感染根管模型的建立：向制备好的根管模型内注射浓度为108CFU/ mL 的粪肠球菌悬液并置于含有1ml 此悬液的1.5ml 离心管内，于厌氧培养箱(37℃、100%湿度)中厌氧培养3w，感染根管模型建立完成，用于后续实验。

(4)根管充填及分组：将根管预备完成的离体牙随机分为7 组，每组20 个样本。分别为A 组：AH Plus 根管封闭剂+热牙胶组；R 组：AH Plus根管封闭剂单尖组；C 组：iRoot SP 根管封闭剂+热牙胶组；D 组：iRoot SP 根管封闭剂单尖组；E组：Hi Flow 根管封闭剂+热牙胶组；F 组：Hi Flow 根管封闭剂单尖组；G 组：热牙胶对照组，为仅充填热牙胶，未使用根管封闭剂。根管充填后，以树脂封闭髓腔，全程均在无菌操作下进行。

(5)细菌计数：将根管充填后的样本均置于无菌RHI 培养基中培养，每隔2d 更换一次新鲜培养液，分别于根管充填20min、1d、7d、14d 时，对各组样本进行细菌计数。具体方法如下：将牙根截成根尖3mm、根中1/ 3、根冠1/ 3，应用GG 钻将根管内根充材料磨除，将收集到的所有磨除的根充材料及牙本质碎屑移入2ml 离心管内，其内加入2mlPRS 缓冲液，均匀震荡1min 后，对细菌悬液进行浓度稀释，方法同1.2.1 的细菌计数方法，全部取样工作均在无菌操作下进行。

1.3 统计学分析 采用SPSS 统计软件23.0版本对数据进行统计分析。计量资料以(均数±标准差)表示，各组间的菌落数、抑菌环直径比较均采用ANOVA 分析。对数据进行方差齐性检验，方差齐者采用LSD-t 检验进行两两比较，方差不齐者采用塔姆黑尼Y2 检验进行两两比较，检验水准α=0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 直接接触实验各组根管封闭剂抑菌效果的比较 各组在与细菌混合培养不同时间后，除阳性对照组各时间点间菌落数无统计学差异外(P＞0.05)，其余各组随着培养时间的延长，菌落数均逐渐增多，各组不同时间点间菌落数均存在统计学差异(P＜0.05)。

各组根管封闭剂在新鲜混合20min、1d 后，AH Plus 组、iRootSP 组、Hi Flow 组三组的菌落数均低于同时间点的阳性对照组(P＜0.05)，且20min、1d 两个时间点的三组间菌落数无统计学差异(P＞0.05)。各实验组根管封闭剂在混合7d 后，抗菌性均有所下降，以AH Plus 组下降最为明显，但三组菌落数仍低于阳性对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，iRootSP 组与Hi Flow 组的菌落数无统计学差异(P＞0.05)，均低于AH Plus 组(P＜0.05)。各实验组根管封闭剂在混合14d 后，AH Plus 组的抗菌性进一步降低，与阳性对照组无统计学差异(P＞0.05)。iRootSP 组与Hi Flow 组的抗菌性也在降低，但两者间无统计学差异(P＞0.05)，而与阳性对照组及AH Plus 组的菌落数均存在统计学差异(P＜0.05)。具体见表1，图1。

图1 各组根管封闭剂混合1d 后菌落数比较

表1 各组根管封闭剂混合不同时间后菌落计数的比较(Log10 CFU/ mL，)

注：相同字母表示在同一时间点组间不存在统计学差异(P＞0.05)。

2.2 三组根管封闭剂抑菌环直径的比较 三组根管封闭剂作用于粪肠球菌1d、3d、7d 后，各组的抑菌环直径递减，各组三个时间点间除1d 与3d间的抑菌环直径无统计学差异外(P＞0.05)，其余时间点间比较均存在统计学差异(P＜0.05)。根管封闭剂作用于粪肠球菌1d 时，三组间的抑菌环直径iRootSP 根管封闭剂组最大，AH Plus 根管封闭剂组最小，但三组间无统计学差异(P＞0.05)。3d 时，各组抑菌环直径均略有缩小，抑菌作用在减弱，但三组间仍无统计学差异(P＞0.05)。7d 时，各组抑菌环直径缩小明显，iRootSP 根管封闭剂组与Hi Flow 根管封闭剂组抑菌环直径无统计学差异(P＞0.05)，且均高于AH Plus 根管封闭剂组(P＜0.05)。对照组蒸馏水作用于细菌后，任何时间均无抑菌环形成。具体见表2，图2。

表2 各组根管封闭剂抑菌环直径的比较(mm，)

表2 各组根管封闭剂抑菌环直径的比较(mm，)

图2 不同根管封闭剂不同时间的抑菌环效果

2.3 建立感染根管模型各组根管封闭剂抑菌效果的比较 各组根管封闭剂作用于感染根管20min后，AH Plus 根管封闭剂+热牙胶组、iRoot SP 根管封闭剂+热牙胶组、Hi Flow 根管封闭剂+热牙胶组三组的菌落数均低于热牙胶对照组(P＜0.05)，三组之间菌落数无统计学差异(P＞0.05)。其余各组菌落数与热牙胶对照组无统计学差异(P＞0.05)。各组根管封闭剂作用于感染根管1d 后，AH Plus 根管封闭剂+热牙胶组、iRoot SP 根管封闭剂+热牙胶组、iRoot SP 单尖组、Hi Flow 根管封闭剂+热牙胶组四组的菌落数均低于热牙胶对照组(P＜0.05)，四组之间菌落数无统计学差异(P＞0.05)。其余各组菌落数与热牙胶对照组无统计学差异(P＞0.05)。各组根管封闭剂作用于感染根管7d 后，各实验组的抗菌性仍存在，菌落数均低于热牙胶对照组(P＜0.05)。iRoot SP 根管封闭剂单尖组、Hi Flow 根管封闭剂+热牙胶组，与其1d 时相比，菌落数更少，抗菌性更强(P＜0.05)。iRoot SP 根管封闭剂+热牙胶组与其1d 时相比，菌落数增加，抗菌性减弱(P＜0.05)。各组根管封闭剂作用于感染根管14d 后，AH Plus 根管封闭剂+热牙胶组、iRoot SP 根管封闭剂单尖组、Hi Flow 根管封闭剂+热牙胶组三组的抗菌性仍良好，均优于其余各组(P＜0.05)，且iRoot SP 根管封闭剂单尖组与Hi Flow 根管封闭剂+热牙胶组的菌落数无统计学差异(P＞0.05)，均优于AH Plus 根管封闭剂+热牙胶组(P＜0.05)。具体见表3。

表3 建立感染根管模型各组根管封闭剂抑菌效果的比较(Log10 CFU/ mL，)

表3 建立感染根管模型各组根管封闭剂抑菌效果的比较(Log10 CFU/ mL，)

3.讨论

根管是一个比较复杂的结构，它存在很多根管预备器械很难到达的结构，比如根管的峡部、侧支根管以及根尖分歧、根尖分叉等部位。同样的，在根管充填时，单纯依靠牙胶尖等核材料也无法实现对这些部位的严密充填，对于根尖部位的充填不严密，往往会导致根尖微渗漏出现的几率增加。因此，根管充填若要保持一个长期且稳定的严密封闭效果，则必须有根管封闭剂的加入，根管封闭剂可进入这些复杂结构内，以保证根尖部位的封闭效果，从而能够更好地降低根管内再感染的风险。AH Plus 作为树脂类根管封闭剂中的代表，它能够通过固化反应时分解的双酚a-二缩水甘油醚以及甲醛从而达到抗菌的目的，其中的甲醛含量挥发极少，降低了细胞毒性，同时又兼具抗菌抑菌性，根尖封闭效果好，但AH Plus 对于根尖周组织有少量的刺激性作用[6-7]。大量实验研究证实，与其它各类的根管封闭剂相比，硅酸盐生物陶瓷类材料无论在生物活性、理化性能以及提高根尖密合性等方面表现更出色一些[8-9]。iRoot SP 根管封闭剂作为其中的代表，可以促进骨组织的再生以及根尖孔的闭合，同时凝固时不产生收缩，充填完成后降低了根尖再感染的发生[10]。HiFlow 根管封闭剂属于硅酸钙基类根管封闭剂的一种，与iRoot SP 的化学成分相似，其预混合而成，不需要调拌，直接注入根管内即可，表现出较理想的生物相容性，很小的遗传毒性，致癌性小，术后疼痛反应轻，生物活性亦较好，可促进成骨分化及矿化，根尖组织耐受，可与牙本质形成良好的化学粘接力[11-12]，同时可用于高温下热牙胶的根管内充填，现已逐渐受到口腔临床工作者的关注。

目前公认的根管治疗理论表明，根管充填不应单单只为了达到密闭根管的效果，更应通过根管内的充填材料(核材料以及根管封闭剂)对根管进行稳定长久地杀菌抑菌作用，控制甚至完全清除根管内的残余细菌，促使根尖周组织加速痊愈[13]。HiFlow根管封闭剂属于新型硅酸钙基类封闭剂，可耐高温，与iRoot SP 均属于预合成的亲水性生物陶瓷类封闭剂。区别在于，HiFlow 根管封闭剂在150℃～220℃的高温下，仍能保持高流动性及粘接性，高温下理化性质稳定，而iRoot SP 根管封闭剂在140℃时已发生了变性，因此不适用于热牙胶的充填[14]。DCY 是检测药物抑菌性能的几种方法之一。有实验人员将DCY 改进后，证实i Root SP 根管封闭剂、AH Plus 根管封闭剂及HiFlow 根管封闭剂三种根管封闭剂对粪肠球菌均有一定地抑菌性，但材料的抑菌性能随着固化时间的延长逐渐衰弱[15]。本实验也证实，各组根管封闭剂在新鲜混合20min、1d 后，AH Plus 组、iRootSP 组、Hi Flow 组均有抗菌性，菌落数均低于阳性对照组，但三组间抗菌性无统计学差异。各组根管封闭剂在混合7d 后，各组仍有抗菌性，且iRootSP 组与Hi Flow 组的抗菌性优于AH Plus 组。各组根管封闭剂在混合14d 后，AH Plus 组抗菌性极低，而iRootSP 组与Hi Flow 组仍能保持抗菌性。抑菌环实验也发现，三组根管封闭剂作用于粪肠球菌1d、3d、7d 后，各组的抑菌环直径递减，说明随着时间的延长，抑菌作用都逐渐在减弱。此外，本实验还建立了感染根管模型，研究了各组根管封闭剂在常温下及热牙胶充填时的高温作用后的抗菌性。结果表明，各组根管封闭剂表现出了良好的抗菌抑菌性，在根管充填14 天后，iRootSP 根管封闭剂+热牙胶组，因高温使其理化性质有所改变，抗菌性降低，但其单尖充填后的抗菌性与Hi Flow 根管封闭剂的抗菌效果优于AH Plus 根管封闭剂，与直接接触实验结果一致。以上均说明，三组封闭剂对粪肠球菌均有抗菌效果，且其抗菌性能与其固化状态、时间有关，但Hi Flow 根管封闭剂与iRootSP 根管封闭剂的抗菌效果在实验中未见差异，分析其原因：iRootSP 根管封闭剂与Hi Flow 根管封闭剂的主要化学成分基本相同，均含有硅酸钙、氧化锆、磷酸钙、氢氧化钙，其中后两者反应产生碱式磷酸钙(Hydroxyapatite，HAP)及水后，水促进硅酸钙发生水化，又生成氢氧化钙及水化硅酸钙(Hydrate calcium silicate，C-S-H)，从而水化反应循环发生，使根管内呈强碱性环境[16]，致使细菌的细胞膜或DNA 受损，蛋白质发生变性，因而iRootSP 根管封闭剂与Hi Flow 根管封闭剂均能够发挥其抑菌抗菌性，细菌很难生存。此外，iRootSP 根管封闭剂与Hi Flow 根管封闭剂的区别在于两者的颗粒分布不同，后者在高热状态下表现出更好的低粘性、高流动性。本实验结果也说明Hi Flow 根管封闭剂在高温状态下，其抗菌效果未发生改变，而AH Plus 根管封闭剂因其释出具有抑菌成分的甲醛量较低，因而其抑菌性低于前两者[17-18]。

综上所述，Hi Flow 根管封闭剂其抑菌性与iRootSP 根管封闭剂相似，值得临床推广。但由于本实验所设置的观察时间尚短，而且是体外研究实验，不能完全模拟出口腔内的真实环境，因此根管封闭剂的抗菌性仍需长时间结合大量的临床病例进一步的研究。