基于网络药理学及分子对接探讨蒙药三味阿拉坦其其格散治疗功能性消化不良的作用机制

彭斯格热希 萨仁高娃 吉日木巴图

内蒙古医科大学民族医药创新中心，内蒙古呼和浩特 010110

蒙药三味阿拉坦其其格散（简称三味散），别名三味木鳖子散、日来那木吉乐，由玫瑰花、金色诃子、木鳖子组成，该方剂最早记载于《蒙医金匮》[1]中，根据《兰塔布》[2]等蒙医古文献和临床经验，三味散是唯一主治综合性蒙医希拉病的方剂。方中玫瑰花能聚拢扩散之消化希拉，为主药；金色诃子清除寒热二种希拉病，为辅药；木鳖子清希拉热，为佐药，对热性和寒性希拉病均有疗效[3]。从三味散的单味药功效来看，玫瑰花能行气解郁、调和气血、止痛，用于治疗食少呕恶、肝胃气痛、月经不调、跌扑伤痛，清希拉、祛赫依功能，治希拉病[4-5]。金色诃子能滋补身体、温胃消食、调理体素功能，治赫依、希拉、巴达干等诸疾[5]。木鳖子能清希拉，清热解毒，治胃肠希拉、黄疸、消化不良、腹胀、肝胆脾热[5]。可见，三种单味药都对胃肠病有疗效。

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是临床常见的功能性胃肠道疾病，起源于胃十二指肠区域，反复发作，无器质性改变，具有上腹胀、食欲不振、餐后饱胀和不适、早饱、上腹部灼烧、恶心和呕吐等症状[6]。调查显示，FD的全球发病率为5.3%～20.4%[7-8]。FD具有反复发作、难以缓解的特点，造成患者反复就医，甚至严重影响患者的生活质量，消耗大量的医疗资源[9]。

1 资料与方法

1.1 三味散有效成分和靶点基因收集

通过BATMAN数据库和TCMSP平台以木鳖子、玫瑰花、金色诃子为关键词检索其有效成分和靶点基因，BATMAN数据库设定为Score≥20进行筛选，TCMSP平台筛选条件为口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，最后得到三味散有效成分及其靶点基因。

1.2 FD靶点收集

通过GeneCards数据库和OMIM数据库以“functional dyspepsia”为关键词检索关于FD疾病靶点。

1.3 “活性成分-作用靶点”网络图绘制

使用DrawVennDiagram网站对三味散靶点基因和FD疾病靶点取交集靶点，并利用交集靶点在Cytoscape软件绘制三味散“活性成分-作用靶点”网络图，随后使用Cytoscape软件中Network Analyzer分析功能对其进行拓扑学分析，根据节点的度值筛选核心活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）网络构建

在STRING平台对获得的交集靶点进行PPI网络绘制，并将PPI网络信息导入Cytoscape软件中，绘制三味散蛋白质-蛋白质PPI网络图，随后使用Cytoscape软件中Network Analyzer分析功能进行拓扑学分析，根据节点的度值筛选核心蛋白。

1.5 KEGG富集分析

利用DAVID数据库对交集靶点进行KEGG富集分析，设定阈值P≤0.5，通路分析选择KEGG，并将得到网络数据使用Rstudio和Cytoscape软件进行可视化分析，绘制其排名前20个条目的气泡图和“通路-靶点”网络图。

1.6 分子对接

将“活性成分-作用靶点”网络图中度值最高的5个核心活性成分与PPI网络中节点度值最高的5个核心蛋白用AutoDockTools软件进行分子对接，验证其相互作用强度，通过PubChem数据库获取核心活性成分结构，通过RCSB PDB数据获取核心蛋白结构，分子对接结果借助Pymol软件进行优化制图。

2 结果

2.1 三味散有效成分及其靶点获取

以OB≥30%、DL≥0.18为 筛 选 条 件 在TCMSP平台进行筛选，以Score≥20为筛选条件在BATMAN数据库进行筛选，收集到亚油酸、槲皮素、油酸等有效成分47个，其中木鳖子9个、玫瑰花18个、金色诃子22个，木鳖子和玫瑰花共有1个、玫瑰花和金色诃子共有1个，共得到其相应的1001个靶点基因。

2.2 FD靶点获取

检 索 词 选 择“functional dyspepsia”，收 集FD靶点，从GeneCards和OMIM数据库中共收集到2476个疾病靶点，取疾病靶点与药物靶点基因的交集，得到两者297个交集靶点。

2.3 三味散“活性成分-作用靶点”网络图分析

使用Cytoscape绘制297个交集靶点的三味散“活性成分-作用靶点”网络图，见图1，网络图通过Cytoscape软件中Network Analyzer功能计算分析，得到347个节点，1109个边条，平均度值为6.4，根据度值筛选排名前10名的核心活性成分，见表1。

表1 度值前10的核心活性成分

图1 三味散“活性成分-作用靶点”网络图

2.4 PPI网络分析

将297个交集靶点，导入STRING数据库，进行PPI网络分析，对获取到的网络数据使用Cytoscape软件绘制PPI网络图，见图2，并进行拓扑学分析，得到了295个节点，5475条边，平均度值为37.1，根据度值筛选前10的核心蛋白，见表2。

表2 度值前10的核心蛋白

图2 PPI网络图

2.5 KEGG富集分析

使用DAVID数据库对297个交集靶点进行KEGG通路富集分析，根据校正后P值进行排序，共获得到135条（P≤0.05）信号通路，选择度值排名前20的核心通路绘制气泡图，见图3；“通路-靶点”网络图见图4。

图3 KEGG富集分析气泡图

图4 “通路-靶点”网络图

2.6 分子对接

利用AutoDockTools软件将“活性成分-作用靶点”网络图中得到的节点度值最高的5个核心活性成分亚油酸、槲皮素、油酸、蕨素A、去甲氧基茵陈色原酮分别与PPI网络图中排名前5位的INS、AKT1、IL6、MAPK3、EGFR核心蛋白进行分子对接，分子对接详细结果见图5，分子对接构象见图6，其中槲皮素与AKT1（-7.9 kCal/mol）结合性最好，从图中可看出槲皮素与AKT1相互作用，结合后呈现较强的亲和能力。

图5 核心活性成分与核心蛋白结合热能图

图6 槲皮素与AKT1分子对接图

3 讨论

FD病因和发病机制可能与胃肠运动功能障碍、胃酸分泌异常、脑肠轴及胃肠激素、肠道菌群失调、幽门螺杆菌感染、精神和心理因素、内脏高敏感性、遗传、环境与饮食习惯和生活方式等密切相关[10]。

对三味散有效成分进行分析，槲皮素具有调节胃肠平滑肌、抗炎和神经保护作用[11]，其可以促进功能性便秘大鼠的胃肠运动[12]，而且实验证明其对胃肠平滑肌具有双向调节作用[13]，槲皮素可通过拮抗5-HT受体调节胃肠蠕动，改善呃逆、恶心、呕吐等胃肠道症状，通过影响p38丝裂原激活蛋白激酶、Bcl-2和Bax的水平，预防与幽门螺杆菌感染相关的细胞凋亡和胃炎[14]。对三味散蛋白进行分析，AKT1是苏氨酸蛋白激酶家族的成员，是PI3K-Akt信号通路中的重要调节分子，位于AKT1上游的PI3K可在受到体内细胞因子和内部环境中各种物理和化学因素刺激后被激活，以产生肌醇，肌醇充当第二信使，调节磷酸化的AKT，进而调节下游相关因子，调节许多细胞周期过程，包括新陈代谢、增殖、生存和生长等，下游eNOS是No的调节酶，No作为信号通路的末端及其重要信使分子，具有抑制胃肠蠕动和胃肠肌肉收缩的功能[15-16]。从三味散信号通路分析，PI3K-Akt信号通路是与胃黏膜修复相关的通路，参与修复受损的胃黏膜和胃上皮细胞的细胞周期调控，PI3K-Akt信号通路有可能是治疗FC小鼠的功能性便秘的重要路径[17]。分子对接结果表明槲皮素与AKT1蛋白结合性最好，也最稳定，槲皮素可能通过作用AKT1蛋白调节PI3K-Akt信号通路在治疗FD中发挥作用。

综上所述，本研究初步证明了三味阿拉坦其其格散主要通过其中成分槲皮素作用于AKT1蛋白，并通过PI3K-Akt信号通路，进而治疗功能性消化不良，可为进一步实验研究和临床应用提供依据。