反应时间对以甘草为原料制备香料挥发性成分的影响

施丰成，梁佳欣，刘远上，薛芳，刘彬，贾学伟，许春平*

(1.四川中烟工业有限责任公司卷烟减害降焦四川省重点实验室，成都 610051；2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，郑州 450002；3.河北中烟工业有限责任公司，石家庄 050051)

甘草，又被称为美草、甜草、国老、灵通、甜根子、密甘，是豆科多年生草本植物干燥的根和根茎[1-2]。甘草提取物活性成分主要有甘草皂苷类的甘草酸、甘草黄酮类、甘草多糖等，具有抗疲劳、抗炎杀菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、保肝、强化记忆力等功效[3-5]。甘草及其提取物作为添加剂广泛应用于饮料、糖果、糕点、保健品、肉制品等食品中。段善海等[6]以甘草为原料制备甘草软糖，其具有浓郁的香气、软绵的口感以及保健功能。马彦花等[7]利用甘草中多糖研制出的甘草多糖饮料是一款功能性饮品，其风味独特，具有抗炎、抗病毒以及护胃功能，提高了甘草产品的附加值。刘安奇等[8]对甘草保健饮料展开介绍，并对后续研究进展进一步探讨。甘草饮料主要包括甘草复合型饮料、甘草发酵饮料、甘草固体饮料；因甘草强大的保健功能，甘草饮料具有良好的开发前景。

近几十年来，美拉德反应一直是食品学、营养学、香料学等领域的研究热点，主要原因是其产物能赋予食品独特的风味、色泽，提高营养价值及安全性[9-11]。石晓岩等[12]以鱿鱼的下脚料为主要原料，确定最佳的酶解和美拉德反应工艺，制备出颜色自然、风味和口感纯正、香气浓郁的鱿鱼粉，可广泛应用到食品和香精香料行业中。张佳敏等[13]以猪骨多肽酶解液为原料，研究影响美拉德反应的因素——氨基酸含量、还原糖含量、pH、反应温度、反应时间，从而确定最佳工艺，制备出最逼真的肉味香精。綦艳梅[14]利用美拉德反应技术，将鸡肉酶解液制备成天然、安全的清炖鸡肉风味膏状香精，其风味浓郁、口感好、留香久。但针对甘草经过美拉德反应后作为香料添加剂的理论研究鲜见文献报道。

本文以甘草为原料制备水提物，与焦糖化料液混配，使其在不同时间下发生美拉德反应制备焦甜香型香料；对不同反应时间下的产物进行GC-MS分析和主成分分析，探讨不同时间下美拉德反应产物的差异，不仅可以开发新型香料，提高甘草的综合利用，而且为其加工工艺研究提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘草：岷县和泰中药材有限公司；无水乙醇、二氯甲烷：天津市富宇精细化工有限公司；葡萄糖溶液、无水Na2SO4：天津市光复科技发展有限公司；NaOH：烟台市双双化工有限公司；乙酸苯乙酯(色谱纯)：美国Sigma-Aldrich公司；无菌水：济南娃哈哈恒枫饮料有限公司。

Q-100A3型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；JJ-1型搅拌器 常州翔天实验仪器厂；MS-H280-Pro型加热器、低温冷却液循环泵、旋转蒸发器、DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；TDZ5-WS型离心机 上海一恒科学仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵 河南省予华仪器有限责任公司；PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-8型数显恒温水浴锅 金坛市华峰仪器有限公司；ZDHW型调温电热套 北京中兴伟业仪器有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；SB-3200DT型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Agilent GC6890-MS5973N型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘草水提物的制备

取1 kg干燥的甘草片原料进行粉碎，过40目筛，加入4000 mL的去离子水，用集热式恒温加热磁力搅拌器在55 ℃条件下搅拌6 h，然后进行离心(转速为4000 r/min，时间为10 min)，取出上清液置于冰箱中保存，沉淀物按上述操作步骤再搅拌12 h，取出上清液，合并滤液后加入旋蒸瓶中进行旋蒸，最终制得甘草水提物，得率为38.6%。

1.2.2 葡萄糖焦糖化料液的制备

先配制浓度为400 g/L的葡萄糖溶液，加入糖质量为20%的无水碳酸钠作为反应助剂，在160 ℃条件下油浴30 min使其发生焦糖化反应，制得葡萄糖焦糖化料液。

1.2.3 不同时间样品的制备

将甘草水提物和焦糖化料液按照3∶1的配比添加混匀，用1 mol/L的NaOH将pH调节至7，然后均分成7等份，在100 ℃条件下进行美拉德反应，分别进行0，20，40，60，80，100，120 min油浴，经油浴后装入不同的样品瓶中。

1.2.4 不同时间样品的嗅香评价

参考YC/T 497—2014[15]中的嗅香评价方法，结合不同时间美拉德反应样品香料的实际情况，选取9种香韵(木香、清香、药草香、甜香、奶香、坚果香、烘烤香、焦糖香、烟熏香)对样品进行嗅香评价。组织5个专家进行评价，量化分值为0～5分，记分单位为0.5分；综合分析数据，剔除异常离群值，将平均值作为各香韵的最终得分。

1.2.5 同时蒸馏萃取甘草中的挥发性物质

分别取不同时间美拉德反应的样品10 g置于圆底烧瓶中，加入100 mL去离子水，摇晃均匀后放入加热套中进行加热处理，同时在蒸馏瓶中加入50 mL二氯甲烷在65 ℃条件下水浴，待样品微沸时计时2 h，冷却后将蒸馏瓶取下，加入无水Na2SO4吸取水分，在55 ℃条件下浓缩至1～1.5 mL，用注射器过孔径为0.22 μm的有机滤膜转移至气质样品瓶中，同时加入20 μL浓度为0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(作为内标)进行气质分析进而得到甘草中的挥发性物质。

1.2.6 GC-MS分析方法

色谱条件：载气：氦气，载气流量：3 mL/min，进样口温度：280 ℃，HP-5MS 色谱柱(60 m×250 μm×0.25 μm)，进样量1 μL，分流比10∶1，升温程序：初起始温度50 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃。

质谱条件：接口温度270 ℃，离子源：EI源，四极杆温度：150 ℃，采集模式：扫描，电子能量：70 eV，质量扫描范围：35～550 amu，检索谱库：NIST 11谱库，溶剂延迟5 min。

1.2.7 主成分分析方法

对美拉德反应的甘草中挥发性物质用IBM SPSS Statistics 26软件进行主成分分析(PCA)，计算主成分特征值和累计贡献率等。根据不同美拉德反应时间的甘草中有关成分的含量标准化值与特征根、特征向量，计算出各主成分值，并以此绘制出散点图。

2 结果分析

2.1 嗅香评价结果分析

为了明确7种不同美拉德反应时间样品的感官特征，采用香气轮廓分析法[16]对7种样品的嗅香进行了评价分析，结果见图1。

图1 不同反应时间样品的嗅香评价结果

由图1可知，随着反应时间的增加，药草香香韵从微有到浓郁又减少，甜香香韵则从浓郁减少至微有，焦糖香香韵一直都较为浓郁，大体上相差不大；7种样品的主香韵(甜香、焦糖香、药草香)较为一致，同时在其他香韵上又存在一定差异。0 min样品则表现出浓郁的焦糖味和甜味，因为样品添加有焦糖化料液且未进行美拉德反应，固有较为浓烈的焦甜味；20，40，60，80 min样品的感官特征较为相似；100 min样品有药草味；120 min样品则具有特殊的烟熏味，可能是由于美拉德反应时间过长。

2.2 GC-MS数据分析

以0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯为内标，进行GC-MS分析后，选取匹配度在80%及以上的挥发性物质进行分析鉴定，鉴定结果见表1。

表1 甘草经不同时间美拉德反应后挥发性物质含量(μg/g)

续 表

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由表1可知，不同时间美拉德反应的甘草混配物共有110种挥发性物质，已鉴定出的挥发性物质的种类主要包括酸类、醇类、酯类、醛类、烯类、酮类、酚类、烷类、胺类、杂环类等。对照样品(未进行美拉德反应)和美拉德反应时间分别为20，40，60，80，100，120 min的样品，已鉴定出的挥发性物质分别有34，21，20，20，27，43，34种。按上述时间梯度甘草混配物中已鉴定出的挥发性物质总量依次为18.04，20.53，66.39，67.16，86.63，127.62，88.22 μg/g，鉴定出挥发性成分含量最多和种类数最多的均是美拉德反应时间为100 min的样品。仅分析进行美拉德反应的样品可知，随着美拉德反应时间的延长，挥发性物质的种类和含量都呈先上升后下降的趋势；但分析对照样品可知，其挥发性物质种类数较多，烷烃种类数最多，但含量都很低，仅占对照样品挥发性物质总含量的8.65%；当进行美拉德反应后，烷烃类物质大大减少，可能是其中的直链烷烃在加热条件下不稳定易分解造成的；而且烷烃类物质分子量大且阈值较高，通常香气不突出，香味特征不明显[17-18]，对香气的贡献比较小。

通过对挥发性物质的种类和含量分析，甘草混配物经美拉德反应后的挥发性物质主要为醇类、酯类、杂环类等。醇类物质主要来自脂肪的氧化以及醛酮等羰基化合物的还原。醇类含量占比最多，以美拉德反应100 min的样品计算达到44.00%，主要是不饱和醇，阈值较低，一般具有令人愉悦的香气[19-20]；其中糠醇、麦芽醇含量较高，都具有焦甜的香气，而且麦芽醇为美拉德反应100 min样品中所特有的香气物质。

酯类物质一般是由脂肪酸和醇类发生酯化反应形成的，有挥发性高和相对阈值较低的特性，多具有令人愉悦的香甜水果香、花香或者酒香味，乙酸糠酯具有水果、坚果和焦糖的气味[21]，棕榈酸甲酯有令人愉快的水果香气，其中乙酸糠酯和Z-10-十四烯-1-醇乙酸酯是在美拉德反应100 min样品中特有的。

杂环类物质是美拉德反应的产物之一，其香味特征突出，主要产生坚果、烘焙或面包味的香味物质[22]。吡嗪类物质一般具有坚果和烧烤味香气，呋喃和吡喃类物质具有焦甜味和烧烤味香气[23-24]。虽然含量少，但因其阈值一般较低，对风味的贡献率很大。添加少量吡嗪和吡啶类物质，便可与烟草很好地协调，掩盖和修饰部分对烟草气味不利的杂气，改善和提高烟草香气[25]。其中吲哚具有花果样的香味，2-甲基吡嗪具有坚果香和咖啡香[26]，在稀释后产生巧克力香，2-乙酰基吡咯具有烤可可香、毛桃青香，存在于菸叶和茶叶中，也是炒榛子挥发性香味组分[27]。

由表2可知，对照样品(美拉德反应时间0 min)未进行美拉德反应，所以没有美拉德反应产物生成；而进行不同时间(20,40,60,80,100,120 min)美拉德反应后，均有美拉德反应特征产物生成，随着美拉德反应时间的增长，其特征香味成分的含量先增加后减少，在100 min时其特征香味成分总量达到最大；而且在进行100 min美拉德反应时，产生的特征香味物质也最多，表明美拉德反应对挥发性物质的产生起促进作用；其中2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、糠醇和麦芽醇含量较高，这些都是具有焦甜香香味的物质，可以突出食品的焦甜香韵。

表2 不同反应时间样品特征香味成分及其含量比较(μg/g)

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2.3 主成分分析

对不同美拉德反应时间的甘草中的111种挥发性成分进行主成分分析，得到主成分载荷矩阵表(见表3)、主成分特征值和贡献率(见表4)。

表3 主成分载荷矩阵

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表4 6种主成分的特征值和贡献率

物质在某主成分中有较高矩阵(载荷的绝对值大于0.8)，则表明该主成分主要反映这些物质的信息。结合表3中数据可以得出：主成分1正相关物质中棕榈酸甲酯、糠醇、2,6-二甲基吡嗪、N,N-二乙基苯胺的载荷值分别为0.949，0.869，0.851，0.804，则主成分1正相关主要反映酯类、醇类和杂环类的物质信息，负相关物质中1-十九碳烯、甲基-10-甲基月桂酸酯、正十六烷、4-己基-四氢-硫代吡喃-1,1-二氧化物等26种物质载荷值均大于0.8，则主成分1负相关主要反映烷类、醇类、烯类、酯类、杂环类的物质信息；主成分2正相关物质(2Z,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯-1-醇、E-8-甲基-9-十四烯-1-醇乙酸酯、Z-8-十六烯、正十六烷等25种物质载荷值均为0.559，则主成分2正相关主要反映了醇类、烷类、烯类、胺类物质的信息，主成分2负相关物质棕榈油酸和棕榈酸甲酯载荷值绝对值较大，则主成分2负相关主要反映了酸类、酯类物质的信息；主成分3正相关的物质糠醇、2,6-二甲基吡嗪、己二酸二辛酯的载荷值较高，则主成分3正相关主要反映了醇类、酯类和杂环类物质的信息，主成分3负相关物质棕榈油酸、油酸、对甲氧基肉桂酸辛酯、糠醛、2,5-二甲氧基甲苯等11种物质，均具有较大矩阵，则主成分3负相关主要反映了酸类、酯类、胺类、醛类物质的信息。

由表4可知，主成分1、主成分2、主成分3的累计贡献率达到72.761%，说明111种挥发性物质可以分别用主成分1、主成分2和主成分3进行主成分分析。

根据表1、表3、表4中挥发性物质含量、载荷值、特征值数据计算出7个样品中的第1、第2、第3主成分值，然后以第2主成分为X坐标，第1主成分为Z坐标，第3主成分为Y坐标，作散点图(见图2)。以第2主成分为X坐标，第1主成分为Z坐标，第3主成分为Y坐标，作分散图(见图3)，代表表3中111种挥发性物质在主成分1、主成分2、主成分3中的分布情况。

图2 甘草进行不同美拉德反应时间后挥发性成分的主成分分散图

图3 甘草进行不同美拉德反应时间后挥发性成分的主成分散点图

由图2可知,7个样品根据距离远近分为3个区域，其中对照样品与其他时间美拉德反应样品距离较远，表明其主成分差异较大；20，40，60，80 min美拉德反应样品距离较近，表明其主成分差异较小；100 min和120 min美拉德反应样品距离较近，表明其主成分差异较小。

由图3可知，对照样品主要包括甲基酮环己酯、甲基-10-甲基月桂酸酯、棕榈油酸、1-十九碳烯等的挥发性主成分，集中在主成分1的负半轴、主成分2的正半轴和主成分3的正半轴；100 min美拉德反应样品主要包括2,3-二氢苯并呋喃、2-乙酰基吡咯、5-甲基-2-呋喃甲醇等的挥发性主成分，集中在主成分1的正半轴、主成分2的正半轴和主成分3的负半轴；120 min美拉德反应样品主要包括乙酸糠酯、1-十五烯、甲基环戊烯醇酮、2-乙基-6-甲基吡嗪等的挥发性主成分，集中在主成分1的正半轴、主成分2的正半轴和主成分3的正半轴。

3 结论

以甘草为原料制备水提物，然后与焦糖化料液混配，分别经过0，20，40，60，80，100，120 min 7个时间进行美拉德反应，用气质联用仪和主成分分析法分析数据，得出挥发性物质的种类包括酸类、醇类、酯类、醛类、烯类、酮类、酚类、烷类、胺类、杂环类等110种，发现在100 min美拉德反应处理后挥发性物质的含量、种类都是最多的，与120 min美拉德反应样品的挥发性成分差异不大，但含量差别较大，其中杂环类、醇类和酯类物质具有特征的焦甜香味,与嗅香评价结果一致，可作为香料添加剂应用于食品等行业，也为甘草加工工艺提供一定理论基础。