环状非编码A RNA及E ApoE基因对诊断脑卒中后血管性痴呆的价值研究

肖海萍,黄杰,谢伟贤,巫碧佳,欧卫谦,张普（广东省佛山市第二人民医院,广东 佛山 528000）

血管性痴呆（VD）属于精神系统常见疾患，近年来发病率呈现出升高的态势，属于慢性进行性疾病，对患者的生活质量与身心健康均产生较为严重的危害[1]。早期的干预治疗能够降低VD的发生，延缓VD的进展[2]。有研究认为，非编码RNA（ncRNA）在VD的进展过程中起了主要作用，人类基因组有超过97%的转录产物为ncRNA，包括微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（LncRNA）以及环状RNA（circRNA），在生命活动中有着广泛多样的生物功能[3]。目前国内外关于circRNA的研究较多，研究结果亦表明其在脑血管病、帕金森病、癫痫等中枢神经系统疾患中存在差异性表达，circRNA有望成为相关疾患的生物学标志物，用于诊断及判断预后[4]。有研究证实，AopE基因型与患者认知功能有关，参与神经系统的正常生长和损伤后的修复过程[5]。目前关于circRNA、LncRNA以及AopE在VD疾患中诊断效能的研究报道均较罕见，故本研究特对VD患者的circRNA、LncRNA以及AopE进行测定，旨在探究上述指标的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年7月-2021年12月佛山市第二人民医院收治的VD患者100例和NVD患者100例。纳入标准：①确诊为缺血性脑卒中；②发病时间＜24h；③患者年龄≤79岁；④患者及家属知情同意。排除标准：①患有阿尔兹海默症疾患或精神系统疾患；②既往有脑卒中或脑外伤病史；③合并自身免疫性疾患；④脑干梗死或大面积脑梗死。VD组男62例，女38例，年龄50-81岁，平均（65.85±5.64）岁，脑梗死部位：基底节区55例，脑叶20例，脑干15例，其他10例，合并高血压34例，糖尿病40例，高血脂28例，吸烟15例，受教育年限2-21年，平均（12.15±3.80）年。NVD组男6 5 例，女3 5 例，年龄5 1-8 2 岁，平均（65.86±6.68）岁，脑梗死部位：基底节区56例，脑叶22例，脑干17例，其他5例，合并高血压36例，糖尿病38例，高血脂30例，吸烟18例，受教育年限3-22年，平均（12.09±3.64）年。另选择同期健康体检者100例作为对照组，其中男67例，女33例，年龄52-79岁，平均（65.53±6.09）岁，吸烟20例，受教育年限2-22年，平均（12.31±3.51）年。三组上述资料比较具有均衡性（P＞0.05），可行比较。本研究已获得医院伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 AopE 无菌收集受试者静脉血5ml，EDTANa2抗凝，按常规方法提取外周血白细胞基因组DNA，用于进行聚合酶链式反应（RCR），方法为PCR荧光探针法。从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组充分融解，快速离心10s。核算本次实验所需的反应数，按照23μl/孔分装量将每种反应液分别装到反应管内，PCR反应管转移至样本区，剩余试剂放回-20℃±5℃冰箱中冷冻避光保存。提取样本DNA，使用天根血液基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Blood DNA Kit DP318）进行血液基因组DNA的提取，所提取的DNA需要用紫外线分光光度计测定浓度及纯度，使得DNA的A260/280在1.8-2.0。将待测样本的基因组DNA、空表对照、弱阳性对照分别加入已装有4种PCR反应液的反应管中，加入量为2μl/孔，待测样本的基因组DNA浓度为5-15ng/μl。盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况。将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。若PCR反应管内加入模板后遇到临时情况不能立即上机，需将加好模板的PCR反应管放于2℃-8℃条件下暂时保存，并在24h内尽快上机进行检测。将PCR反应管放置在仪器样品上开始进行PCR扩增，记录好放置顺序。开始进行PCR扩增，反应结束后根据扩增曲线，划定合适基线（一般起始设定为3，终止设定为15）和荧光阈值（一般将阈值划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间），得到不同通道Ct值并按照相应的表进行结果判定。

1.2.2 LncRNA 抽取空腹静脉血5ml于EDTANa2抗凝，分离血清，并用2个新的EP管分装，于-80℃冰箱中保存。取出EP管解冻，加入Trizol试剂，颠倒混匀后再加入氯仿，剧烈震荡，离心取上层无色液体至新EP管，加入异丙醇混匀离心弃上清液后加入焦碳酸二乙酯溶解，参照逆转录试剂盒准备逆转录制备cDNA，使用PCR进行测定。

1.2.3 circRNA 抽取空腹静脉血5ml于EDTANa2抗凝，在3000r/min的速率下离心10min，用Agilent Human circRNA芯片做检测与分析，下一步进行总RNA提取，并对芯片筛查结果做PCR验证。

1.2.4 认知功能评分 缺血性脑卒中患者治疗3个月后对VD组患者进行认知功能评分，采用简明精神状态量表（MMSE）进行，总分30分，轻度（13-23分）、中度（5-12分）、重度（＜5分）。

1.3 统计学分析 使用SPSS20.0软件分析数据。对照组Hard-Weinberg遗传平衡定律吻合度采用χ2检验。计量资料以()表示，行F检验，两组间比较行t检验；计数资料以(%)表示，行χ2检验，检验水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 各组AopE基因频率分布 经χ2检验，对照组AopE基因型频率符合Hard-Weinberg遗传平衡定律，P值分别为0.180和0.460。VD组以及NVD组AopEε4等位基因频率均高于对照组（P＜0.05），VD组和NVD组AopEε3等位基因频率均低于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组AopE基因频率分布[n(%)]

2.2 各组AopE、circRNA、LncRNA水平比较 AopE、circRNA、LncRNA比较，VD组＞NVD组＞对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组AopE、circRNA、LncRNA水平比较()

表2 各组AopE、circRNA、LncRNA水平比较()

注：与对照组比，*P＜0.05；与NVD组比，#P＜0.05。

2.3 不同VD严重程度AopE、circRNA、LncRNA水平比较 AopE、circRNA、LncRNA比较，轻度认知障碍组＜中度认知障碍组＜重度认知障碍组（P＜0.05）。见表3。

表3 不同VD严重程度AopE、circRNA、LncRNA水平的比较()

表3 不同VD严重程度AopE、circRNA、LncRNA水平的比较()

注：与轻度障碍组比，*P＜0.05。

2.4 AopE、circRNA、LncRNA在VD中的诊断效能分析 AopE、circRNA、LncRNA联合诊断VD的敏感度和特异度分别为70.00%和90.00%，AUC为0.855，其效能优于各指标单独诊断效能（Z=4.736、4.024、3.963，P=0.000、0.000、0.013，均＜0.05）。见表4及图1。

表4 AopE、circRNA、LncRNA诊断效能分析

图1 AopE、circRNA和LncRNA在VD中诊断价值的ROC图

3 讨论

VD是仅次于阿尔兹海默病引起老年群体痴呆第二大病因[6]。随着社会老龄化的推进以及脑血管疾患的高发，VD的发病人数也与日俱增[7]。据统计，我国60岁以上的人群中VD患病率约为2.44%，仅次于阿尔兹海默病相关性痴呆[8]。故而，现阶段VD的早期诊断以及防治对于脑血管疾病的患者而言至关重要。截至目前，国内外仍旧缺乏诊断VD的早期敏感指标，据调查，VD患者中仅有1/3的群体能够在早期接受及时的诊断及干预，大部分患者就诊时均已处于VD晚期，给生活带来了较大的困扰，亟需寻找敏感、有效、方便且经济的诊断指标。

有学者指出，缺血性脑卒中的发生与AopE基因多态性相关，高血压、糖尿病、高脂血症、冠状动脉粥样硬化等作为缺血性脑卒中的危险因素，亦与AopE基因的多态性也存在一定的相关性[9-10]。在ε2、ε3、ε4这3种等位基因中，ε4亲和力最高，ε2亲和力最低，因此对于血脂代谢产生相反的影响[11]。本研究中，VD组以及NVD组AopEε4等位基因频率均高于对照组（P＜0.05），VD组和NVD组AopEε3等位基因频率均低于对照组（P＜0.05），提示AopE基因可能通过调控血脂参与缺血性脑卒中的发生与发展中[12]。LncRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ转录而成，既往研究及学者均认为其是“垃圾”分子[13]。近些年随着分子技术的不断发展，LncRNA的作用及生物学功能逐渐被挖掘。相关研究指出，LncRNA可广泛存在于人类血液、体液以及组织中，且血浆LncRNA在经过反复冻融后仍能够保持稳定，且各类型的LncRNA通常在正常组织中为较低表达，但在阿尔兹海默症患者海马组织以及脑血管疾病患者脑组织中均呈高表达[14-16]。本研究中，LncRNA比较，VD组＞NVD组＞对照组（P＜0.05），提示VD组患者出现LncRNA高表达的情况，与上述学者的观点较为吻合。circRNA含量丰富且具有较高的组织特异性，已成为研究热点，在心脏病以及阿尔兹海默病等多种疾病中作用突出，同时也与脑血管疾病的病理过程有着密切的关系[17-18]。本研究依据MMSE评分对VD患者的认知障碍情况进行划分，发现AopE、circRNA、LncRNA比较，轻度认知障碍组＜中度认知障碍组＜重度认知障碍组（P＜0.05），提示随着认知障碍的加重，AopE、circRNA以及LncRNA的水平也随之上升并参与VD患者认知障碍的进展中。为明确AopE、circRNA和LncRNA在VD疾患中的诊断价值，本研究绘制ROC曲线发现，AopE、circRNA、LncRNA联合诊断VD的敏感度和特异度分别为70.00%和90.00%，AUC为0.855，其效能优于各指标单独诊断效能（P＜0.05），提示对上述指标进行联合检测有助于临床中VD的诊断，尽早发现患者有无认知障碍状况的发生，保障患者生命安全[19-20]。

综上所述，VD患者存在AopE、circRNA以及LncRNA表达异常升高的情况，上述指标联合检测有助于临床判断VD患者有无认知障碍情况的出现，便于后续治疗的开展，进而促进患者的预后。但对于AopE、circRNA以及LncRNA在VD患者中的病机尚未明了，需要后续更加深入以及扩大样本量的研究。