酸橙同源四倍体种质发掘及形态特征分析

任可心，蒋景龙，阳 妮，王 倩，王国军，李 丽，丁德宽

(1 陕西理工大学生物科学与工程学院/化学与环境科学学院，陕西汉中，723001；2 汉中市农业技术推广与培训中心，陕西汉中，723000；3 城固县果业技术指导站，陕西汉中，723200)

酸橙(CitrusaurantiumL.)为芸香科柑桔属植物，一般枝条硬且多具针刺，叶片狭长，翼叶较大，叶柄较长，果实趋于扁圆形，果皮粗糙易剥离，中心柱多为空虚，酸度极高[1]。原产于亚欧大陆东南部，我国为主要起源地，主要栽培于湖北、江西、浙江、四川和湖南等省，具有独特的风味和较高的营养价值，可被用于加工香料、果汁和膳食营养补充剂。传统中药中的枳实和枳壳主要由用酸橙及其栽培变种的果实制成。现代药理学研究表明，酸橙具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌和防止动脉粥样硬化等功效[2]。酸橙变异丰富，在柑桔类属系统分类中占有极其重要的地位，是柑桔遗传进化研究和种质资源创新与改良的重要材料。此外，酸橙具有根系发达、树龄长、抗逆性强、积累特殊次生代谢物等特征，是宝贵的柑桔材料，且受到人工选择的影响较小，保存着珍贵的遗传多样性，在柑桔育种以及开发应用等方面具有广阔的发展前景。

多倍体是指含有3套或3套以上完整染色体组的生物体，在自然界中广泛存在，很多重要的作物比如小麦、土豆、甘蔗和棉花都是多倍体[3]。多倍体可以是异源多倍体或同源多倍体，分别可通过2n配子有性繁殖或体细胞染色体加倍产生，同源多倍体基因组由相同的染色体组组成，通常起源于种内杂交，而异源四倍体基因组由不同的亚基因组组成，通常起源于不同物种之间的种间杂交[4-5]。大量研究证明，多倍体对逆境的耐受能力强，更能适应环境的变化，在进化中占优势。比如四倍体的枳、薯蓣、水稻和大翼橙等，具有更强的抵抗干旱[6]、低温[7]、高温[8]及盐胁迫[9-11]的能力。因此，柑桔多倍体种质资源的挖掘可为提高柑桔非生物胁迫能力的研究提供参考，具有重要的意义和价值。选育四倍体的方式有很多种，例如秋水仙素诱导、实生筛选、体细胞融合等[12]。由于柑桔部分珠心胚可自发进行染色体加倍，柑桔2n配子发生的频率较高且较普遍，所以实生筛选是目前获得柑桔四倍体的主要方法。梁武军等[13]从10个柑桔砧木实生后代中发掘自然发生的四倍体，表明从珠心胚实生系中寻找同源四倍体是一条可行、有效的途径。周锐等[14]基于根系特征、叶片特征和油胞等形态特征进行筛选，从6个多胚性二倍体柑桔品种发掘出72株四倍体后代。笔者参考前人的方法，利用陕西汉中独特的酸橙资源进行了四倍体材料筛选研究。

1 材料与方法

1.1 材料培养与处理

酸橙果实(图1)于2020年10月25日由陕西省汉中市城固县果业技术指导站在城固县原公镇垣山村(北纬33°09′24″、东经107°20′00″)同一株树上采集。剥取并统计酸橙果实内的种子，然后在0.5 mol/L NaOH溶液中搓洗10～15 min，去除种子表面的果胶，再用0.2 mol/L次氯酸钠溶液消毒3～5 min，清水洗净后选取饱满种子剥除种皮，将种子放入45 ℃水浴锅中催芽3～4 h。将催芽后的种子移至营养土(泥炭∶珍珠岩=3∶1，体积比)中继续培养，培养条件为光照强度4 000 lx，光照周期16 h/8 h(白天/夜间)，温度(25±2)℃。

图1 酸橙果实与种子

1.2 多倍体鉴定

1.2.1 形态初选 待酸橙幼苗长至5～6片真叶时(约需5个月)，根据周锐等[14]的形态筛选法(与二倍体相比，四倍体植株表现出主根变短、直径变粗，须根数量减少，叶片颜色加深，叶片显著变厚，叶形指数变小，油胞密度降低等)对酸橙幼苗进行初步筛选，并进行后续验证。

1.2.2 染色体计数 参考LAN等[15]的根尖染色体压片法，对疑似四倍体进行染色体观察。首先切取1 cm根尖并用流水涮去表面土壤，之后在饱和对二氯苯溶液中预处理2 h，在卡诺固定液中固定2 h，在1 mol/L HCL中酸解1 min(60 ℃水浴)，20%卡宝品红溶液染色，压片，最后在莱卡显微镜下检测染色体数目并拍照。

1.3 SSR(Simple Sequence Repeat)分子标记鉴定

采集二倍体和四倍体的叶片，参照新型快速植物基因组DNA提取试剂盒——离心柱型(北京百泰克生物技术有限公司)技术流程，分别提取基因组DNA，取部分DNA提取液用灭菌的ddH2O稀释至100 ng/μL且4 ℃备用，剩余DNA提取液置于-20 ℃冰箱冻存。试验所用SSR引物(见表1)参考李益等[16]，由上海Sangon公司合成。PCR反应总体系为20 μL：模板DNA 2 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 10 μL(苏州近岸蛋白科技有限公司)，10 μmol/L正向引物2 μL，10 μmol/L反向引物2 μL，灭菌ddH2O 4 μL。PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，总共32个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表1 SSR引物序列

PCR完成后的处理，参照谢小燕等[17]的方法并做适当改动。取2.5 μL PCR产物，采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压150 V)约2 h 10 min后进行银染，最后用Epson Expression 10000XL影像扫描仪采集图像。

1.4 形态学观察

1.4.1 生长性状观察 以同一时期培养的二倍体为对照组，观察四倍体植株的生长状况。用直尺测量株高、叶长和叶宽，叶形指数=叶长/叶宽。在灯光照射下，统计叶片上表皮1 cm2范围内的油腺(油胞)个数，计算油胞密度。

1.4.2 叶片气孔观察 参照Oustric等[18]的方法，对四倍体及其二倍体的叶片气孔大小和密度进行统计分析。在同时期的二倍体、四倍体植株上，选取同一节位处的叶片，将其切成小块状，在电子扫描显微镜下观察叶片下表皮的气孔形态特征，以保卫细胞的长度和横径作为气孔的长度和横径，每次观察10个视野，重复3次，测得气孔长度、气孔宽度以及气孔密度(个/mm2)。

1.4.3 叶片解剖结构观察 参考付盼等[19]的石蜡切片法，观察四倍体和二倍体的叶片解剖结构。摘取四倍体和二倍体的叶片，清洗干净后用剪刀剪去叶子两边，留下主脉附近，再剪几个大小合适的方形叶片，于FAA(Formalin-acetic acid-alcohol)固定液中固定24 h，番红染色液染色48 h，脱水透明后包埋，凝固后修块。用HESTION-ERM3100半自动轮转式石蜡切片机切片，切片在36 ℃烘箱中烘12 h，然后进行脱蜡透明和番红固绿染色处理，最后中性树胶封片保存。在Nikon ECLIPSE E600显微镜下观察并拍照。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 根尖细胞染色体观察

根据形态学初步观察，从1 620株酸橙实生苗中筛选出了疑似四倍体32株，再根据根尖染色体计数法最终筛选获得7株酸橙四倍体，酸橙四倍体群体的自然发生率为0.43%。酸橙二倍体根尖细胞的染色体数目为18条，四倍体根尖细胞的染色体数目为36条(见图2)。

注：a：二倍体；b：四倍体

2.2 SSR分子标记鉴定分析

以二倍体为对照，用3对引物对筛选的四倍体进行分子鉴定的结果表明，四倍体植株的扩增条带与二倍体植株的扩增条带完全一致(见图3)。可见，酸橙四倍体均可能是由二倍体植株珠心胚自然加倍而来的同源四倍体。

注：1～3酸橙二倍体，4～10酸橙四倍体。

2.3 植株形态学观察

观察结果表明，四倍体植株生长缓慢，植株明显矮化，株高仅为二倍体的71%；四倍体植株的主根粗、侧根少，叶片相较于二倍体植株更浓绿、更宽圆。二倍体植株平均叶长和叶宽为7.38 cm和2.22 cm，四倍体植株平均叶长和叶宽为5.53 cm和2.7 cm。四倍体植株叶片表现为变短变宽，从而导致叶形指数变小，仅为二倍体叶片的61%。酸橙四倍体和二倍体叶片下表皮的气孔大多数呈现为椭圆形或者近圆形。四倍体叶片气孔大于二倍体，气孔长度是二倍体叶片的1.41倍，气孔宽度是二倍体的1.40倍；气孔密度和油胞密度相比较于二倍体极显著(p<0.01)降低，分别为二倍体的54.9%和30.6%。可见，相较于二倍体，四倍体的叶片气孔显著增大，气孔密度显著减小(见图4和表2)。

注：a：整株；b：根；c：叶片；d：二倍体油胞；e：四倍体油胞；f：二倍体气孔；g：四倍体气孔。

表2 酸橙二倍体与同源四倍体植株部分形态参数的比较

2.4 叶片解剖结构观察

用石蜡切片法对酸橙二倍体和四倍体进行叶片解剖结构观察。叶片主脉横切结果显示，二倍体和四倍体的叶片主脉均呈不规则半圆形，四倍体叶片主脉突出较二倍体明显，表明四倍体叶片主脉较二倍体更发达。薄壁细胞(Pa)位于维管束外侧，四倍体的薄壁细胞面积明显大于二倍体。与二倍体相比，四倍体叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度均极显著(p<0.01)增大，分别增加了44%、32%、36%、64%和37%。四倍体的海绵组织间隙较二倍体大。此外，四倍体叶片的栅海比、叶片结构紧密度和叶片结构疏松度分别是二倍体的1.21、1.13和0.94倍(见图5和表3)。

表3 酸橙二倍体与同源四倍体植株叶片解剖结构参数比较

注：a、b：酸橙二倍体叶片；c、d：酸橙四倍体叶片。2x：二倍体；4x：四倍体；UE：上表皮；LE：下表皮；ST：海绵组织；PT：栅栏组织；Ph：韧皮部；X：木质部；Pa：薄壁细胞。

3 讨论

植物经过多倍化后往往表现出比亲本二倍体更强的抗寒、抗旱、抗盐碱能力[20]，因此人们已经将多倍体育种视为提高植物抗逆性的有效手段。目前已知获得多倍体的方法有秋水仙素诱导、体细胞融合、实生选种等。秋水仙素诱导多倍体这种方法是有效的，并被报道在各种植物中诱导获得了多倍体；然而，此方法较耗时，并经常产生嵌合体。体细胞杂交也是一种可用于获得多倍体的技术，但需要高水平的专业知识，而且效率非常低，并受到原生质体再生能力的限制。由于柑桔多数品种具有多胚性且珠心细胞存在自然加倍现象，所以柑桔实生选种是一种有效选育多倍体的一种方法，并且实生选种具有操作方便、无污染和无毒性等特点[21-23]。柑桔多倍体往往与二倍体有一些形态学差异，比如根粗、叶片宽圆、叶色浓绿等，根据这些形态特征结合根尖染色体压片法筛选可快速获得四倍体植株。本研究通过形态初选，从酸橙的1 620株群体实生苗中获得了32株疑似四倍体植株，再经根尖染色体压片方法筛选，最终确定了7株为四倍体，形态初选成功率为21.87%，群体四倍体自然发生率为0.43%。使用3对多态性SSR引物对由饱满种子获得的酸橙四倍体植株来源进行SSR鉴定，结果表明四倍体的带型与其二倍体亲本完全一致，说明多胚性酸橙种子中形成的四倍体来自珠心细胞染色体的自然加倍。

植物体多倍化后往往会发生各种各样的生物学特性变化，比如器官具有巨大性[24]。在本研究中，酸橙四倍体植株相比较于二倍体植株明显矮化、主根粗短、叶片宽圆、叶色浓绿等。这种形态特征变化与王雨亭等[25]和蒋景龙等[26]的研究结果相似(四倍体新余蜜桔和四倍体衢州香橙植株相较于各自的二倍体植株，在根和叶上都表现出了巨大性)。因此，根据四倍体与二倍体植株的形态差异进行初步筛选是一种快速且有效的方法。

细胞的巨大性是区别植物多倍体和二倍体的重要指标之一，气孔增大、气孔密度下降是多倍体的典型特征。该特征已经普遍应用于苹果[27]、桑树[28]、梨[29]等植物多倍体鉴别。在本研究中，酸橙四倍体与二倍体相比，叶片气孔大小与密度都有极显著差异。

多倍体植物一般会表现出叶片增厚、变大的趋势[30]。在本研究中，四倍体酸橙叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度都极显著大于二倍体，这与张丞慧等[31]在新疆野苹果四倍体和二倍体上的研究结果一致。目前普遍认为栅栏组织与海绵组织厚度比(P/S)和叶片结构紧密度(CTR)可作为植株抗逆性的重要指标。刘婉秋等[32]以丹参为材料，研究发现丹参三倍体的P/S和CTR相比较于二倍体都显著增大，具有更强的光合作用能力和防止水分蒸腾的能力，抗旱性更强。韩淑华等[33]研究发现，四倍体桑品种陕桑402-1的P/S和CTR都极显著大于其同源二倍体亲本新一之濑，并且进一步利用隶属函数分析法得出陕桑402-1的抗旱性高于新一之濑。在本研究中，酸橙四倍体的P/S和CTR极显著大于二倍体，表明酸橙四倍体的抗逆性相比于二倍体更强。这对于柑桔育种来说有非常重要的意义。

酸橙长久以来被广泛应用于宽皮桔类和甜橙的砧木。本研究根据植株主根短、叶片宽圆、叶色浓绿和油胞密度减少等形态特征进行初步筛选，再利用根尖染色压片法筛选，从酸橙1 620株群体实生苗中筛选得到7株四倍体植株。这对酸橙种质资源的发掘，尤其是抗逆性更强的优良柑桔砧木的选育有重要意义。