不同方法脱虾壳蛋白的效果研究

随着我国水产加工业的发展，水产品加工废弃物激增。然而这些废弃物中往往含有可利用的高价值物质，包括蛋白质、矿物质、ω-3不饱和脂肪酸、甲壳素、虾青素和其他生物活性物质等[1]。其中甲壳素是迄今为止仅次于纤维素的第二大可再生天然聚合物，每年的生物合成量约为100亿t[2]。甲壳素资源丰富并具有许多特殊的生物理化性质，被认为是可替代石油的生物燃料和其他功能性化合物的生物质来源[3]。作为21世纪环境友好型的新型生物高分子材料，甲壳素及其衍生物在医学、制药、化妆品、食品工业、农业、环保、生物等相关科学技术领域都展现出了巨大的潜力，具有广阔的应用前景和较高的商业价值。

我国主要从虾、蟹的甲壳中提取甲壳素及壳聚糖[4-6]。目前提取甲壳素、壳聚糖的方法主要有传统酸碱法、物理法、酶法、化学改良法、发酵法、微生物合成法等[7-9]。制取过程主要为脱钙及脱蛋白，为了解各方法在脱蛋白方面的效果及对比各方法的脱除效果，最终选择以单一酶解及复合酶解为研究对象进行实验。

1 材料与方法

1.1 实验材料

虾壳，广东省湛江市北桥菜市场；冰乙酸（AR）、无水乙醇（AR），广东化学试剂工程技术研究开发中心；酸性蛋白酶、中性蛋白酶，夏盛公司；碱性蛋白酶，诺维信中国销售代理广州明曜公司。

1.2 实验仪器

电子分析天平FA2104N，上海蒲春计量仪器股份有限公司；紫外分光光度计TU-1810DASPC，广州市红图仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，常州荣华仪器制造有限公司；pHS-3C酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；电热鼓风干燥箱DHG-9035A，上海一恒鼓风干燥箱。

1.3 实验方法

1.3.1 虾粗甲壳素蛋白质含量测定

称取干燥后样品0.2 g，分别用20 mL 4%NaOH浸泡样品，将这3份样品于90 ℃水浴锅中水浴3 h，冷却过滤，分别收集好滤渣和滤液，滤液于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。将上述定容的滤液用移液枪移取1 mL于试管中，然后加入2 mL蒸馏水（稀释3倍），混匀，用紫外分光光度计测定280 nm和260 nm处的吸光度，另用20 mL 4%的NaOH溶液加蒸馏水定容至50 mL容量瓶中，做空白对照。蛋白质含量（mg·mL-1）计算公式为蛋白质含量=1.31A280-0.57A260。

1.3.2 水打醇洗粗虾甲壳素制备

新鲜虾下脚料加蒸馏水，于豆浆机高速打浆2 min，然后用筛网过滤，滤渣中加入食用乙醇，于豆浆机再打0.5 min，然后用筛网过滤收集滤渣，水洗4次，备用。

1.3.3 单一酶解

（1）酸性蛋白酶酶解后再碱提。样品加水（料液比1∶10），调pH值为5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%计），50 ℃水浴锅中水浴3 h，90 ℃灭酶10 min，冷却过滤，分别收集好滤渣和滤液，过滤时用少许蒸馏水多次冲洗烧杯残渣，滤液于100 mL容量瓶中定容，用蒸馏水定容至刻度，用紫外分光光度计测定280 nm和260 nm处的吸光度，测定蛋白质含量。同时烘干滤渣，测定蛋白质残留量。

（2）碱提后再用碱性蛋白酶酶解。样品约5 g，分别加入50 mL 0.1%NaOH溶液（pH=13.17）和0.05%NaOH溶液（pH=12.65）浸泡，于90 ℃水浴锅中水浴3 h。冷却过滤，分别收集好残渣和滤液，过滤时用少许蒸馏水多次冲洗烧杯残渣，滤液于100 mL容量瓶中定容，用蒸馏水定容至刻度，待测。将过滤好的滤渣，加入25 mL蒸馏水和2.5 μL的诺维信碱性蛋白酶（按底物0.1%计），测定其pH值为8.0，于50 ℃水浴锅中水浴3 h，90 ℃灭酶10 min，同时测定滤液蛋白质含量和滤渣蛋白质残留量。

（3）复合酶解。①样品约5 g，按料液比1∶10加水，调pH值为5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%计），50 ℃水浴锅中水浴3 h，调pH值为7.0，加入中性蛋白酶（按底物0.1%计），50 ℃水浴锅中水浴3 h，测定滤液和滤渣蛋白质含量。②样品约5 g，按料液比1∶10加水，调pH值为5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%计），50 ℃水浴锅中水浴3 h，调pH值为8.0，加入碱性蛋白酶（按底物0.1%计），50 ℃水浴锅中水浴3 h，测定滤液和滤渣蛋白质含量。③样品约5 g，按料液比1∶10加水，调pH值为7.0，加入中性蛋白酶（按底物0.1%计），50 ℃水浴锅中水浴3 h，调pH值为8.0，加入碱性蛋白酶（按底物0.1%计），50 ℃水浴锅中水浴3 h，测定滤液和滤渣蛋白质含量。

（4）复合酶解后再碱提取。样品复合酶解后烘干0.2 g，加入4 mL 0.1%氢氧化钠于90 ℃水浴3 h，分别测定滤液和滤渣蛋白质含量。

1.4 数据分析方法

采用Excel 2007整理实验数据，使用SPSS 20.0软件处理数据。每个实验重复3次，实验结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 虾粗甲壳素蛋白质含量测定

由图1可知，虾下脚料的蛋白含量高于处理完毕的水打醇洗样品，而0.1%NaOH提取液中蛋白质含量为20.23%，0.05%NaOH提取液中蛋白质含量为18.1%。由以上数据可知在碱提过程中0.1%NaOH的提取效果比0.5%NaOH的提取效果好。

图1 不同浓度的NaOH提取蛋白质效果对比图

2.2 单一酶解

由图2、图3、图4可知，水打醇洗虾壳样品经酸性蛋白酶酶解再碱提后残余的蛋白质含量分别为2.68%（0.1%NaOH）、3.59%（0.05%NaOH）。碱 提后再碱性蛋白酶酶解残余的蛋白质含量分别为2.55%（0.1%NaOH）、3.44%（0.05%NaOH）。由此可知，在单一酶解过程中碱提加碱性蛋白酶酶解的提取效果优于酸性蛋白酶加碱提，且用0.1%的NaOH提取优于使用0.05%的NaOH提取。

图2 蛋白酶酶解后酶解液中蛋白质含量比较图

图3 碱提液中蛋白质含量对比图

图4 虾壳中残留蛋白质含量对比图

2.3 复合酶解

由图5、图6、图7可知，在复合酶解的过程中初次酶解中性蛋白酶酶解液中蛋白质含量最高为28.57%，第二次酶解中碱性蛋白酶酶解液中蛋白含量最高为24.89%。烘干后残留蛋白质含量分别为11.51%、5.60%、5.57%。由此可知，复合酶解时由酸性-中性提取效果最差，酸性-碱性，中性-碱性效果差异不大，中性-碱性略优于酸性-碱性。

图5 复合酶解第一次酶解蛋白含量对比图

图6 复合酶解第二次酶解液蛋白质含量对比图

图7 烘干后粗甲壳素残留蛋白质含量对比图

2.4 复合酶解后干燥样品再碱提取蛋白质

由图8、图9可知，复合酶解后再用低浓度的碱液提取过程中，酸性-中性提取量最高为10.07%，酸性-碱性最低为4.6%。而滤渣中残留蛋白质含量也是酸性-碱性最低为3.61%。结合复合酶解实验结果分析可知，复合酶解中酸性-碱性的提取效果最好，酸性-中性提取效果最差。

图8 0.1%碱提取液中蛋白质含量对比图

图9 甲壳素中蛋白质含量对比图

3 结论

本实验主要研究不同方法脱虾壳蛋白质的效果，其中包括酸性蛋白酶酶解后再碱提，碱提后再用碱性蛋白酶酶解以及采用复合酶包括酸性蛋白酶、碱性蛋白酶及中性蛋白酶。通过对比不同方法处理后烘干样品中蛋白质的含量即可得出脱蛋白效果最好的方法，根据实验数据可知，复合酶解提取效果略低于单一酶解再碱提的效果，而复合酶解后再使用低浓度的碱液进行提取可使残留蛋白质达到较好的效果。碱提后再用碱性蛋白酶酶解，残留蛋白质含量最低，即该方法脱蛋白效果最好。