桂香温经止痛胶囊对EMs在位内膜细胞凋亡的调节机制

丛慧芳,李阳,于洋,张天婵,3*

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

子宫内膜异位症(以下简称内异症)是育龄期妇女的临床常见病，随着医疗科技和社会环境的改变，内异症的发病率增高可达10%～15%[1]。内异症引起的痛经、性交痛、下腹痛和不孕等，可影响患者的生活和工作，甚至影响患者的心理健康。现代医学对内异症机制的认识主要以子宫内膜细胞随经血逆流进入盆腔生长为主导。内异症的形成需要子宫内膜细胞经历腹水、腹腔细胞吞噬作用后，仍存活在腹膜进行黏附、侵袭和血管形成[2]。

郎景和教授认为内异症患者与非内异症患者的在位内膜分子和生物学有差异，并提出“在位内膜决定论”[3]。根据内异症的在位内膜决定论可知，在位内膜具有更加强大的生存能力。与生存相关的细胞机制包括细胞分裂、凋亡和血管形成等。细胞凋亡是基因调控下的细胞程序性死亡，低凋亡水平可促进组织细胞更好地增殖生长，在肿瘤研究中较多，因内异症的侵袭转移等特性与肿瘤相似，故内异症研究中凋亡机制研究日趋增多[4]。bcl-2属于抗凋亡因子，是调节线粒体凋亡Bcl-2家族的一员，bcl-2的增加可抑制细胞凋亡[5]。Caspase3是水解酶Caspase家族的一员，可调控晚期凋亡，Caspase3表达增加可以促进细胞凋亡[6]。

西医对于内异症的治疗以腹腔镜、卵巢抑制和辅助生殖为主，但在内异症的早期，疾病不易发现，尚未发现早期比较可靠的血清标志物[7]。中医对于内异症引起的症状具有很好的缓解作用，可有效缩减病灶，并可在早期进行干预，达到治疗效果。丛慧芳教授临床中治疗内异症颇有心得，并创立桂香温经止痛胶囊用于临床治疗。前期研究表明桂香温经止痛胶囊具有很好的临床疗效[8-9]。本研究选取内异症在位内膜细胞模型，观察桂香温经止痛胶囊含药血清对内异症细胞模型中细胞凋亡情况，并探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 主要药物及试剂

桂香温经止痛胶囊：主要成分为肉桂、葫芦巴、山茱萸、制吴茱萸、醋延胡索、川楝子、盐小茴香、白芷、川牛膝、细辛、白芍、五灵脂、水蛭。批准文号：黑药制字Z20160029，此药为黑龙江中医药大学附属第二医院院内制剂，6粒/d，每日3次口服。Vimentin抗体试剂(北京中杉金桥公司)；CK19(北京中杉金桥公司)；MTT溶液(上海富衡生物)；DMEM/F12；PBS缓冲液(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；DMSO(Gibco公司)；RNA提取试剂盒、TRIZOL、dNTP、氯仿、MMLV、异丙醇、DEPC、ddH2O、MgCl2、琼脂糖、溴化乙锭、MOPS、乙酸钠、EDTA、溴酚兰等。

1.2 主要实验仪器

37 ℃、5%CO2细胞培养箱(赛默飞世尔371)；分光光度计(法国SECOMAM UviLine 9100/9400)；电泳槽(君意JY-SCZ2)；离心机(德国RUMA-ZENTRIFUGENM Z35B80)、Mulitskan酶标仪(美国热电K3)、实时荧光定量PCR仪(美国罗氏LightCycler480)。

1.3 实验动物

清洁级SD雌性大鼠20只，体质量(200±20)g，用于制备含药血清，购买于青岛大任富城畜牧有限公司，动物合格证号：SCXK(鲁)20140001。实验室由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，温度22～25 ℃，相对湿度40%～75%。

2 实验方法

2.1 样品采集

选取2019年6月—2020年12月于黑龙江中医药大学附属第二医院进行开腹手术、腹腔镜手术切除卵巢子宫内膜异位症(巧克力囊肿)患者25例，年龄35～49岁，术后病理检查证实为子宫内膜异位症，且按1985年美国生育学会修订EMs(子宫内膜异位症)分期标准(r-AFS)，全部为Ⅲ～Ⅳ期病例，术后刮取宫腔内子宫内膜组织，标记为EMs组。选择非EMs而进行子宫切除术的患者16例，年龄35～49岁。术后刮取宫腔内子宫内膜组织，标记为对照组。取得EMs组和对照组的在位子宫内膜组织分别置入2～8 ℃的4 mL DMEM/F12培养液无菌瓶中，置于冰盒中立即送入实验室，尽快进行细胞的分离培养。内膜组织采集均得到患者知情授权，医院伦理委员会批准。所有患者既往月经规律，无其他内、外科并发疾病、无炎症、免疫性及其他恶性疾病，术前1个月内未接受激素类及GnRH类药物治疗。

2.2 含药血清制备

将40只适应性饲养的SD大鼠随机分为两组，桂香组(20只)和空白组(20只)，参照“动物和人体表面积折算的等效剂量比率表”[10]换算给药，桂香组按照20 mL/kg体质量进行桂香温经止痛胶囊浓缩剂灌胃，2次/d，连续灌胃5 d，最后1 d 2次灌胃时间相隔2 h；空白组每日按照60 mL/kg体质量进行生理盐水灌胃，2次/d，连续灌胃5 d，最后1 d 2次灌胃时间相隔2 h，其他喂养环境一致。给药第7天末次给药后1.5 h，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)分别麻醉两组大鼠，开腹并使用负压采血管于腹主动脉采血，每只约取8 mL，3 000 r/min离心20 min，分离血清后，将同一组血清混合，用0.2 μm微孔过滤膜过滤灭菌，获得空白血清和桂香血清组血清，置入-20 ℃冰箱保存备用。

2.3 细胞培养及分组

将所取患者的EMs组、对照组在位内膜组织从低温运送的培养液中取出，生理盐水清洗。清洗结束后吸净生理盐水；将内膜组织加入10倍的消化液，并在消化液中剪碎内膜组织，碎片体积约为1 mm3，剪碎后转移置离心管中，放入细胞培养箱；离心机离心后，用含有15%胎牛血清及1.5%青链霉素(青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL)的DMEM培养液接种于培养皿内，培养成功后进行传代，取第2～3代生长良好的细胞用于后续检测实验。其中EMs组将作为EMs细胞模型进行后续干预实验，将EMs细胞模型分为4组，分别为空白组、空白血清组、桂香血清组和PI3K抑制剂组，并进行加药干预。

2.4 细胞鉴定

细胞爬片固定后PBS漂洗，再用0.5%Triton X-100室温孵育20 min，PBS漂洗2次，滴加3% H2O2，室温静置15 min，PBS漂洗。正常山羊血清封闭液滴加盖玻片，滴加Ⅰ抗(1∶100～1∶200稀释，鼠抗人角形蛋白CK19或鼠抗人波形蛋白Vimentin)，37 ℃孵育1 h。滴加二抗，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗盖玻片后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育10～15 min。漂洗后滴加DAB孵育2～10 min显色，冲洗，脱水，中性树脂胶封片，光镜下观察。

2.5 MTT法不同药物的最佳干预浓度和干预时间

取生长良好的在位子宫内膜细胞，将细胞计数调整至5×104/mL～10×104/mL，将细胞悬液加入96孔板中，每孔加入100 μL，将接种好的细胞培养板放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中正常培养，直至细胞单层铺满孔底(或>90%)。将培养好EMs细胞进行分组，分别为空白组、空白血清组、桂香血清组和PI3K抑制剂组，各组设置5个浓度梯度，其中空白血清组和桂香血清组按照2.2中血清浓度进行稀释，① 空白组：按照正常培养基添加5孔；② 空白血清组：0%、5%、10%、20%、30%；③ 桂香血清组：0%、5%、10%、20%、30%；④ PI3K抑制剂组：0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L。加入不同培养基后的细胞分别在细胞培养的24 h、48 h、72 h、96 h检测其增殖能力，检测时将96孔板每孔培养液吸净加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃继续培养4 h。在Formazan结晶充分形成后，保留结晶，每孔加入150 μL DMSO，低速振荡使结晶物充分溶解(避光)。酶标仪波长492 nm，参数620～630 nm，测量各孔的吸光值(OD)。

2.6 RT-PCR技术检测Caspase3、bcl-2 mRNA的表达

PCR引物通过NCBI中Primer设计，并委托吉林省库美生物科技有限公司合成引物序列(见表1)，收集各组细胞，TRIZOL试剂裂解的细胞提取总RNA，逆转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR仪进行扩增，检测各目的基因，并采用2-△△Ct方法对结果进行分析计算其表达量。配制好的PCR反应溶液置于PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93 ℃ 1 min预变性，93 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环。

表1 引物序列

2.7 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计学分析，组间两两进行比较，若数据符合正态分布，则采用t检验；若数据之间不符合正态分布，采用秩和检验，以P<0.05表示差异有统计学意义，并使用Graphpad Prism 8绘制可视化图进行展示。

3 实验结果

3.1 细胞鉴定

第三代培养的细胞进行免疫细胞化学染色，波形蛋白存在于间质细胞内，故免疫细胞化学染色选用间质细胞特异的波形蛋白抗体进行[11]，染色后阳性的标志为基质细胞胞架,呈棕黄色，如图1a所示。角蛋白存在于腺上皮细胞内，故免疫细胞化学染色选用上皮细胞特异的细胞角蛋白抗体进行染色，染色后阳性的标志为腺上皮细胞胞架,呈棕黄色，如图1b所示。

注：a.波形蛋白抗体；b.角蛋白抗体。图1 免疫细胞化学染色图(×400)

3.2 两组细胞凋亡因子Caspase3和bcl-2 mRNA的表达差异

经荧光定量PCR检测显示，与对照组相比，bcl-2 mRNA在EMs组表达较高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，Caspase3 mRNA在EMs组表达较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 两组细胞bcl-2和Caspase 3 mRNA表达比较

3.3 MTT法测各组最佳干预剂量

增殖曲线可以看出，5%的含药血清、10 μmol/L的LY294002为最佳干预剂量，为保持恒定变量，空白血清浓度与含药血清浓度选择应一致，根据所选干预剂量对EMs进行干预，以评价含药血清的治疗作用，见图2。

注：a.空白血清增殖曲线；b.不同剂量含药血清增殖曲线；c.不同剂量LY294002增殖曲线。图2 不同样本增殖曲线图

3.4 桂香温经止痛胶囊含药血清对EMs细胞模型凋亡的影响

3.4.1 4组细胞中Caspase3 mRNA的表达

经荧光定量PCR检测显示，Caspase3 mRNA在空白组和空白血清组表达较低，桂香血清组和LY294002组表达较高；其中空白组与空白血清相比，差异无统计学意义(P>0.05)；桂香血清组与LY294002相比，差异无统计学意义(P>0.05)；空白血清与桂香血清组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 4组细胞中Caspase3 mRNA水平比较

3.4.2 4组细胞中bcl-2 mRNA的表达

经荧光定量PCR检测显示，bcl-2 mRNA在空白组和空白血清组表达较高，桂香血清组和LY294002组表达较低；其中空白组与空白血清相比，差异无统计学意义(P>0.05)；桂香血清组与LY294002相比，差异无统计学意义(P>0.05)；空白血清与桂香血清组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 4组细胞中bcl-2 mRNA水平比较

4 讨论

子宫内膜异位症为妇科常见难治性疾病，在中医中属于“血瘀证”，所致的痛经、不孕等可反复困扰患者。中医药在缓解痛经、促进怀孕方面具有良好的临床效果。丛慧芳教授在临床中治疗内异症颇有疗效，并带领课题组创立了桂香温经止痛胶囊，且在临床治疗中得到验证。

桂香温经止痛胶囊是丛慧芳教授多年治疗寒凝血瘀内异症的经验方痛愈舒颗粒经剂型变化而成，使之成为患者接受度更高、更方便携带的药物。此方乃少腹逐瘀汤与当归四逆汤化裁而来，具有温经散寒，化瘀止痛之功。少腹逐瘀汤对于寒凝血瘀型的痛经、子宫内膜异位症等具有很好的治疗效果[12]，还可提高内异症子宫内膜容受性，促进受孕[13]。当归四逆汤是以桂枝汤为底方，可调和阴阳，再加当归通草倍大枣，治疗寒凝于内的疾病尤为擅长[14]。桂香温经止痛胶囊以吴茱萸下行温肝肾，暖胞宫，辛能散结，温能行血，可入肾散寒为君药；小茴香、肉桂、葫芦巴，温肾阳，散寒瘀，助吴茱萸温肾散寒；五灵脂、元胡、川楝子止痛化瘀，细辛辛散，可散络脉瘀滞；水蛭善于搜刮络脉之瘀，直达病所；细辛化瘀通络，引诸药入络；白芷辛散通窍，与细辛同用，可宣肺理气；温阳散寒不可不养血补气，否则阳无所依，气无所载，故增加白芍、当归，活血补血，牛膝引药下行，山茱萸补肝肾，山药补后天之本，且可滋阴。补先天养后天，养气血，使药物发挥温肾散寒，活血止痛之功。

BCL-2家族是调控线粒体凋亡的主要相关因子，Bcl-2通过与Bak相互作用，导致线粒体通透性增加，使其中的CytC释放进入细胞质中，触发Caspase3的级联反应而促进细胞凋亡。Bcl-2家族中包含促凋亡因子bax和抑凋亡因子bcl-2。当线粒体凋亡启动，则会出现bax的活化增加，bcl-2表达降低，从而促进细胞凋亡。有研究表示与非EMs患者相比，EMs患者子宫内膜中Bax表达显著降低，而bcl-2表达显著增加，说明EMs与低凋亡水平相关[15]。李斌等[16]同样对临床中EMs患者和非EMs患者子宫内膜进行检测分析，发现EMs在位内膜中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及bcl-2都显著高于异位内膜组和对照组，而Bax显著降低。KAYA等人[6]研究发现血清Caspase3水平与EMs的严重程度呈正相关。解胜兰等[17]通过对EMs的在位、异位内膜以及非EMs的在位内膜进行免疫组化法检测标本中Caspase3、Caspase8的表达，发现其在EMs的异位、在位和对照组中的表达依次下降，且随着RAFS评分的增加表达量逐渐降低，说明Caspase3、Caspase8的低表达与EMs发生发展相关。故通过对bcl-2、Caspase3的检测可对细胞凋亡水平进行评价，其中bcl-2体现了线粒体的凋亡情况，Caspase3体现了晚期凋亡情况。本实验桂香温经止痛胶囊含药血清与凋亡抑制剂LY294002相比，具有一致性，均可降低内异症细胞的增殖，并可通过促进bcl-2 mRNA的表达，抑制Caspase3 mRNA的表达抑制细胞凋亡水平。

综上所述，本研究说明桂香温经止痛胶囊可抑制内异症细胞模型的增殖，使得bcl-2 mRNA表达上调，Caspase3表达下调抑制细胞凋亡，促进内异症症状改善。中药对疾病的治疗属于整体调理，辨证论治，可涉及多个靶点，多条信号通路。故对中医药的研究可更加广泛。