左归丸对早衰和初老大鼠下丘脑-垂体-卵巢FSHR、LHR和ER表达的影响

赵粉琴，赵艳，刘洁颖，苟雅姣，胡芝霞

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO)调控卵巢的生殖和内分泌功能，下丘脑分泌促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)，促进垂体前叶分泌促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)，FSH的生物学作用主要是促进卵巢卵泡的生长和卵泡颗粒细胞的增生，刺激卵泡细胞上LH受体产生；LH的生物学作用主要是促进卵泡的成熟和排卵，刺激卵泡内膜细胞产生雌激素，维持女性内分泌。

FSHR和LHR主要存在于卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞，是促性腺激素(Gn)及各类细胞因子调控卵泡发育、成熟及排卵的重要受体，GnRHa能抑制FSH对FSHR的诱导[1]，从而使卵巢FSHR表达及FSHR与FSH的结合量减少[2]，影响卵泡的发育和成熟,但是在FSHR和LHR下丘脑和垂体组织的表达未见相关报道。左归丸作为经典补肾药[3]，在防治生理性或功能性卵巢功能衰退(POF)方面研究较多，对下丘脑-垂体-卵巢激素受体表达未见报道。基于此本研究对不同阶段大鼠体内血清(FSH、LH和E2)水平变化以及在下丘脑、垂体、卵巢不同部位表达的差异性以及左归丸的干预作用进行研究，验证左归丸促进卵巢功能恢复的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SPF级SD大鼠，4～6月龄(青年,相对于人18～20岁)60只，11～12月龄(初老,相对于人40～45岁)40只，体质量(220±20)g。甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(甘)2015-0005。普通饮食、饮水，室温18～25 ℃，相对湿度60%～70%，自然昼夜节律光照。

1.2 主要药品和试剂

顺铂注射液(云南植物药业有限公司，国药准字H53021740)；补佳乐(拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20130009)；性激素ELSIA试剂盒，LH(MM-0624R1)、FSH(MM-0566R1)、E2(MM-0575R1)均来自江苏菲亚生物科技有限公司；一抗(GeneTex)：LHR(GTX64387,稀释比例为1∶100，抗兔)，FSHR(GTX64391，稀释比例为1∶100，抗兔)，ER(GTX22746，稀释比例为1∶100，抗鼠)；DAB显色试剂盒(中杉金桥)；二抗(中杉金桥)：生物素标记山羊抗鼠IgG(SP-9002)，生物素标记山羊抗兔IgG(SP-9001)；三抗(中杉金桥)，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液(SP-9001)。

1.3 实验动物模型制备、分组以及给药

青年大鼠60只给予顺铂注射液6 mg/(kg·w)，共2次，建立卵巢早衰大鼠模型。空白组给予等剂量的生理盐水腹腔注射。将造模成功的大鼠随机分为模型组、模型+补佳乐组、模型+左归丸(低、中、高)剂量组,每组10只；另40只初老大鼠，随机分成空白组，初老+左归丸(低、中、高)剂量组，每组10只。补佳乐灌胃药物剂量0.09 g/(kg·d)，制备成0.09 mg/mL；左归丸剂量9.45 g/(kg·d)，制备左归丸浓度煎剂为0.945 g生药/mL，低剂量0.472 5 g生药/mL,中剂量0.945 g生药/mL,高剂量4.725 g生药/mL。左归丸组成为熟地黄、炒山药、山萸肉、牡丹皮、泽泻、茯苓，由甘肃中医药大学附属医院提供，每只大鼠灌胃2 mL/d，连续用药21 d。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 大鼠血清性激素水平的检测

治疗结束后，心前区取血1.5 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清移入EP管，用96孔ELISA试剂盒检测血清中FSH、E2和LH水平。

1.4.2 免疫组化法检测大鼠下丘脑、垂体、卵巢组织中FSHR、LHR、ER蛋白表达

实验结束，处死大鼠，分离下丘脑、垂体、卵巢，切片，脱水。3 %过氧化氢室温避光作用20 min。正常山羊血清封闭液室温作用30 min。倒去封闭液，滴加一抗(FSHR或LHR或ER)工作液(1∶100)，4 ℃ 孵育过夜。分别滴加生物素化二抗(SP试剂盒)、三抗，分别室温作用30 min，再滴加DAB显色液(1∶20)，室温避光作用5 min，显微镜下控制显色时间，一旦出现最佳颜色，使用蒸馏水停止其显色反应，苏木素复染，酒精脱水，中性树胶封片。同时设染色对照，每张切片随机选取5个不同区域。使用Image-Pro Plus软件(6.0版)测量卵巢内组织中FSHR、LHR、ER阳性表达的平均光密度值(IOD)。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 大鼠血清FSH、LH和E2含量变化

实验过程中除正常组以外，其余各组有大鼠死亡。与空白组比较，早衰模型组大鼠血清FSH增高(P<0.01)，LH增高，E2降低，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，模型+左归丸高剂量组降低大鼠血清FSH水平(P<0.01)；与初老组比较，初老组+左归丸高剂量组降低大鼠血清FSH水平(P<0.05)，结果见表1。

表1 各组大鼠血清FSH、LH和E2含量

2.2 各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢部位FSHR、LHR和ER表达分析

2.2.1 各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢部位FSHR表达分析

与空白组比较，模型组、初老组大鼠下丘脑、垂体和卵巢组织FSHR表达下降(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，补佳乐组、模型+左归丸高剂量组、初老+左归丸高剂量组大鼠下丘脑、垂体和卵巢组织的FSHR表达增加(P<0.01，P<0.05)；与初老组比较，初老+左归丸高剂量组明显增加下丘脑、垂体、卵巢组织FSHR表达(P<0.01)。结果见表2，图1。

表2 各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢部位FSHR表达分析

图1 下丘脑、垂体和卵巢组织FSHR免疫组化表达 (×400)

2.2.2 各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢部位LHR表达分析

与空白组比较，模型组、初老组大鼠下丘脑和垂体组织LHR表达下降(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，补佳乐组、模型+左归丸(中、低剂量组)和初老+左归丸低剂量组大鼠下丘脑和垂体组织LHR表达明显降低(P<0.01)，而模型+左归丸高剂量组和初老+左归丸高剂量组大鼠下丘脑、垂体和卵巢组织LHR表达明显增加(P<0.01)；与初老组比较，左归丸(高、中剂量组)明显增加大鼠垂体组织LHR表达(P<0.01)。结果见表3，图2。

表3 各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢部位LHR表达分析

2.2.3 各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢部位ER表达分析

与空白组比较，模型组大鼠下丘脑和卵巢组织、初老组大鼠下丘脑和垂体组织ER表达下降(P<0.01)；与模型组比较，初老组、模型+左归丸高剂量组和初老+左归丸(高剂量)低大鼠下丘脑、模型+左归丸(高、中剂量组)和初老+左归丸(高、中、低剂量组)大鼠垂体和卵巢组织ER表达明显增加(P<0.01)；与初老组比较，初老组+左归丸(高、中、低剂量组)大鼠垂体组织ER表达明显增加(P<0.01)，结果见表4，图3。

表4 各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢部位ER表达分析

图3 下丘脑、垂体和卵巢组织ER免疫组化表达(×400)

3 讨论

POF主要是卵泡数量减少，雌激素水平下降，出现一系列近期和远期并发症，严重影响女性生殖、生命健康[4]。女性生殖和内分泌功能由HPO轴的正负反馈调控，FSH和LH，优先激活它们在下丘脑-垂体-卵巢-子宫性腺轴中的同源受体发挥重要作用[5-6]，促进卵泡发育、成熟以及排卵，同时卵泡发育合成的E2，与其富含ER的下丘脑、垂体、卵巢和子宫组织[7]结合发挥作用[3]。所有激素在体内生理作用的强弱，除了与生物效应量呈正比，还受激素受体(R)活性度高低的影响[8]。

FSHR和LHR对卵巢卵泡的发育、成熟以及排卵起着重要调控作用，而且不受外源性雌激素含量的影响[9]。关于雌激素及其受体结合，在生殖系统、中枢神经系统和内分泌系统等发挥重要作用的报道很多[10-11]，尤其是FSHR和LHR是卵巢颗粒细胞膜表面的重要受体，两者的表达水平与卵母细胞的成熟程度呈现正相关[12]，在相同年龄的情况下，ER水平低下其卵巢衰老更快，其功能退化更为明显，反作用于腺垂体，腺垂体减少促卵泡素分泌[13]。研究认为FSHR 的缺陷会导致受体结合FSH 以及信号传导的异常，配子生成障碍，导致不孕[14],因而研究卵巢功能早衰(POF)下丘脑-垂体-卵巢性腺轴上FSH受体(FSHR)、LH受体(LHR)以及雌激素受体(ER)含量变化就显得尤为重要。

本研究采用顺铂腹腔注射致POF[15]，血清性激素水平结果显示，早衰大鼠和初老大鼠血清FSH增高(P<0.05),LH增高，E2含量降低，但各组雌激素水平比较之间无差异(P>0.05)，因为雌激素不是判断卵巢功能衰退的主要指标[16]。经治疗后发现左归丸能减少早衰和初老大鼠FSH和LH分泌，升高E2水平，促进各级卵泡发育，达到改善卵巢功能的目的，尤以左归丸高剂量组作用显著(P<0.05)。

通过免疫组化的组织病理学研究显示，早衰大鼠和初老组大鼠下丘脑组织中FSHR和LHR表达明显下降(P<0.05)，而初老组大鼠ER表达没有下降。早衰大鼠和初老组大鼠垂体组织中LHR表达明显下降(P<0.05)，而早衰大鼠FSHR没有明显变化，ER表达下降(P<0.05)；初老组大鼠FSHR表达明显下降(P<0.05)，而ER没有明显变化。在卵巢组织早衰大鼠FSHR和ER表达明显下降(P<0.05)，而LHR没有明显变化。说明卵巢功能衰退FSH和LH效应组织的相应FSHR和LHR含量表达减少早于雌激素受体。这与研究卵巢上位腺体功能的异常可能先于卵巢功能的衰退有关，与血清雌激素水平无关一致[17]。

因为下丘脑是雌激素正负反馈作用以及垂体负反馈作用的效应器，早衰和初老大鼠血清FSH和LH水平升高，雌激素水平下降，进而反馈性影响下丘脑、垂体和卵巢组织FSHR、LHR和ER含量，FSH、LH和雌激素作用强度降低，卵母细胞停止发育及闭锁，雌激素合成下降，即POF状态。

左归丸作为经典补肾养血方剂，具有填精益髓功效[18]，切合肾主生殖，肾精亏虚乃天癸竭，形坏而无子之病机。本研究显示左归丸能上调下丘脑、垂体和卵巢组织FSHR和ER表达，提高FSH和雌激素作用效度，改善卵巢功能的作用。这可能与左归丸有类雌激素样作用，并能增加雌激素效应组织受体含量，促进雌激素与其特异性受体的结合，改善卵巢功能，同时是否与左归丸有改善化疗引起的氧化应激损伤，延缓衰老有关[19]。