牦牛附睾DPP4 基因CDS 区的克隆和表达研究

王红梅，杨刘玥玲，吴逸韬，杨献康，郑旭昕，赵旺生（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010）

二肽基肽酶-4（Dipeptidyl Peptidase-4，DPP4）又称腺苷脱氨酶复合蛋白26，是一种细胞表面蛋白酶，属于脯氨酰寡肽酶家族，DPP4 蛋白可选择性切割脯氨酸位于倒数第二位的肽中的氮末端二肽从而降解信号肽，发挥自身生物活性。同时，DPP4 与腺苷脱氨酶ADA 相互作用作为细胞内信号转导的调控因子从而控制细胞迁移和增殖。在体内主要在组织内皮细胞和上皮细胞中表达。随着年龄的增长，男性生殖功能出现总体下降，主要表现为精子数量的减少和体内雄激素的降低,作为精子的转运载体，睾丸管周细胞（HTPCS）在雄性生殖过程中发挥突出作用，在探究睾丸功能衰退的过程中发现睾丸管周细胞发生特异性改变，在出现线粒体网络减少、溶酶体数量增加等蛋白质紊乱现象的同时出现巨噬细胞迁移抑制因子（）和水平升高。因此推测可能在雄性生殖过程中发挥作用。

三维结构显示，DPP4 是二聚体蛋白，每个单体的亚基由一个/水解酶结构域和八叶螺旋桨结构域组成，在自然条件下，-螺旋桨结构域和催化结构域共同参与DPP4 单体缔合过程形成同型二聚体，丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸形成催化三联体的残基，而水解酶结构域中的酪氨酸对催化活性至关重要。DPP4 独特的螺旋结构可作为蛋白质互相作用的支架，-螺旋桨有4～8 个叶片，每个叶片由包含30～50 个氨基酸的重复亚基组成，相邻的螺旋桨叶片环可形成配体与抗体的接触位点。DPP4 作为广泛表达的酶，通过锚定的跨膜分子和可溶性循环蛋白转导作用，膜相关和可溶性DPP4（sDPP4）都具有催化活性，精液和肾脏是可溶性DPP4（sDPP4）的天然来源。目前，有关基因在牦牛附睾组织中的表达未见详细研究，本实验通过克隆获得牦牛基因的CDS 区，利用荧光定量检测其在牦牛附睾组织不同部位的表达并对其蛋白进行生物信息学分析，旨在为研究DPP4 在牦牛附睾上皮细胞中的功能提供基本数据。

1 材料和方法

1.1 睾丸分离 实验所用睾丸来源于四川阿坝红原，所用睾丸经过Hanks 溶液漂洗3 次后分离附睾和睾丸，附睾组织分为附睾头、附睾体、附睾尾3 部分，分离后立即放置于液氮中保存备用。

1.2 试剂及器材 TRIzolplus总RNA 提取试剂由Gen enode 提供；Moloney Murine Leukemia Virus 逆转录酶及2X SG Fast qPCR Master Mix 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。QUAWELL 超微量紫外分光光度计（UV-5500PC）购自艾本德（上海）国际贸易有限公司，荧光定量PCR 仪（T100 Thermal Cycler）购自美国伯乐公司。

1.3 牦牛附睾总RNA 的提取和反转录 Trizol 试剂提取附睾头、附睾体、附睾尾总RNA，QUAWELL 超微量紫外分光光度计检测其浓度。RNA 反转录，步骤一：基因组DNA 去除，反应体系（10 μL）：5×gDNA Buffer 2.0 μL，总RNA 2.0 μL，RNase-Free ddHO 6.0 μL。反应过程42℃，3 min。步骤二：反转录反应，反应体系（10 μL）：10 × King RT Buffer 2.0 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1.0 μL，FQ-RT Primer Mix 2.0 μL，RNase-Free ddHO 5.0 μL。将混合液加入到步骤一的反应液中，混匀后，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，产物于-20℃冰箱保存。

1.4 目的基因克隆 以牦牛附睾组织反转录所得的cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增体系（20.0 μL）：DNA 聚合酶10.0 μL，双蒸水7.0 μL，上下游特异性引物各1.0 μL（10 μmol/L）混匀，附睾头、体、尾的cDNA 各添加1.0 μL。反应过程：预变性94℃4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s；以上过程循环40 次，后经72℃2 min 的延伸。将产物电泳检测后进行DNA纯化并将目的片段和载体连接、进行转化及鉴定后，经成都擎科梓熙生物公司测序。

1.5 荧光定量PCR 反应体系（10.0 μL）：2x SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，取上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL 混匀，PCR-grade water 3.7 μL，模板DNA 0.5 μL，以每样3 个重复为对照，反应条件：预变性95℃3 min，95℃2 s，60℃25 s；以上过程循环40 次。定量结果利用SPSS19.0 软件分析。

1.6 DPP4 蛋白质生物信息学分析 BioXM 2.6 软件分析牦牛的核苷酸和氨基酸序列；在线软件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）对DPP4进行蛋白质理化性质分析，NCBI 的BLAST 比对其氨基酸同源性，并使用MEGA6.0 软件对其系统进化树进行构建，NeTPhos3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/NetPhos/）预测牦牛DPP4 蛋白磷酸化位点，TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测DPP4 蛋白跨膜区，其他相关生物学预测方法同之前的研究。

2 结果与分析

2.1 目的基因和内参基因的引物 参考NCBI 中公布的牦牛基因mRNA 序列（登录号：XM_005897282.2）以及内参基因（登录号：NM_001037471.2），利用Primer Premier 5.0 软件设计引物。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，具体信息见表1。

表1 目的基因和内参基因的引物

2.2 牦牛基因克隆产物 克隆结果显示，获得牦牛附睾序列2 519 bp。CDS 区分析发现，基因CDS 长度为2 298 bp，共编码765 个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG（图1）。

图1 牦牛DPP4 基因的碱基和氨基酸序列

2.3 牦牛DPP4 蛋白质的理化信息 DPP4 氨基酸分子式为CHNOS，分子量为88.37 ku，包含765 个氨基酸，其中含量最高是丝氨酸，占总氨基酸数的8.8%；其次是亮氨酸，占总氨基酸数的7.7%；酪氨酸，占氨基酸总数的7.1%；半胱氨酸含量最低，占氨基酸总数的1.4%。负电荷残基（Asp+glu）和正电荷残基（Arg+Lys）总数分别为84 和71；等电点5.92，总亲水系数-0.39，脂肪系数为78.99，不稳定系数为45.38，由此可将DPP4 蛋白归为带负电的不稳定蛋白。

2.4 牦牛基因的物种同源性分析 通过BLAST对基因同其他物种进行对比，发现牦牛基因核苷酸序列与绵羊（登录号：XM_004004660.5）、山羊（登录号：XM_005676046.3）、野猪（登录号：NM_214257.1）、猕猴（登录号：XM_011744180.2）、黑猩猩（登录号：XM_009443585.3）的同源性分别是98.78%、98.61%、92.12%、90.17%、90.13%。MEGA 11.0 构建以上物种的核苷酸序列系统进化树，可看出牦牛与绵羊、山羊亲缘关系较近（图2），符合物种进化规律。

图2 DPP4 的进化树

2.5 牦牛DPP4 蛋白结构 牦牛DPP4 蛋白存在102 个磷酸化位点，其中包括50 个丝氨酸位点，27 个苏氨酸位点，25 个酪氨酸位点。蛋白质二级结构预测显示，共765 个氨基酸组成DPP4 蛋白，其中18.17%（139 个）处于-螺旋区；6.14%（47 个）处于-转角；30.46%（233个）位于延伸链；45.23%（346 个）氨基酸处于无规则状态。亲疏水性分析显示（图3），DPP4 蛋白在第24个氨基酸位点存在最大值2.956，此位点疏水性最强；第179 个氨基酸位点上存在最小值-2.589，此位点氨基酸亲水性最强。从蛋白整体结构看，亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中未见明显疏水区，可将DPP4 整体视为亲水性蛋白，这与其理化性质预测相符。在线网站TMHMM 2.0 分析DPP4 蛋白的跨膜区，结果显示牦牛DPP4 蛋白的1～6 位氨基酸位于细胞膜内，在7～29 位氨基酸之间形成跨膜螺旋区（图4）；信号肽预测结果显示DPP4 蛋白不存在信号肽（图5），SoftBerry 预测牦牛DPP4 蛋白亚细胞定位于细胞膜上。

图3 牦牛DPP4 蛋白亲疏水性预测图

图4 牦牛DPP4 蛋白的跨膜结构预测图

图5 牦牛DPP4 蛋白的信号肽预测图

2.6 牦牛基因在附睾不同区域的表达 对牦牛附睾头、附睾体、附睾尾的cDNA 进行qPCR 扩增并进行实时荧光定量检测，基因在附睾头部表达量低于其在附睾体部和附睾尾部的表达（＜0.01）（图6）。

图6 DPP4 基因在牦牛附睾不同部位的相对表达情况

3 讨 论

DPP4 蛋白是一种多功能II 型细胞表面糖蛋白，其功能可以根据它们的细胞内或细胞外定位、细胞类型、寡聚或聚合状态以及配体、辅因子或产物的浓度发生变化。抑制剂通过降低内源性肠促胰岛素失活，进而刺激胰岛素的释放，调节空腹血糖、餐后血糖和糖化血红蛋白HbA1c 水平，被广泛用于治疗糖尿病。然而，在糖尿病男性病例研究中发现西格列汀对精子参数和睾酮水平存在不良影响。患者使用西格列汀后，在有效控制血糖的同时出现精子质量和精子数量明显下降，甚至出现无精子状况，而停用西格列汀三个月后后精子质量恢复至可受孕状态。此外，二甲双胍联合抑制剂治疗二型糖尿病时发现，与单一二甲双胍治疗相比，抑制剂协同治疗时，患者MDA、LHP水平显著降低，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平显著升高，证实抑制剂可以明显改善患者氧化应激情况。GSH-Px 作为机体抗氧化应激的重要指标，可保护精子在附睾运输和尾腔储存过程中免受过氧化物的不利影响，研究发现谷胱甘肽过氧化物酶家族成员在牦牛附睾不同部位表达以附睾头表达量显著高于附睾体和附睾尾，与本实验结果相反，推测可能与一同参与精子氧化应激过程。本实验通过克隆获得牦牛系列长2 519 bp，其中CDS区长2 298 bp，编码765 个氨基酸。DPP4 蛋白是不稳定带负电的亲水蛋白。研究发现，其蛋白磷酸化位点有102 个，蛋白结构以无规则卷曲和-螺旋为主，在此基础上延伸。荧光定量结果显示，在附睾头中低表达，在附睾体和附睾尾高表达，与雄牛生殖组织的研究相符。目前有关对精子发生过程中发挥何种作用仍待深入研究，根据现有研究，使用抑制剂后对雄性精子带来的不利影响得到验证，可推测在精子发生过程中发挥一定作用，可为后续研究提供一定思路。

4 结 论

本实验成功克隆牦牛基因，基因在附睾头部的表达显著高于其在附睾体和附睾尾的表达。对牦牛DPP4 蛋白进行了生物信息学分析发现，DPP4 蛋白为不稳定的带负电的亲水蛋白，在牦牛生殖过程中具体发挥何种作用有待进一步研究，本研究可为进一步研究基因在牦牛附睾上皮细胞中的功能提供一定基础资料。