单细胞测序技术及其在畜禽遗传育种中的应用研究新进展

彭 巍，贾可欣，张子敬，刘 贤，蔡翠翠，李欣淼，雷初朝，陈 宏，黄永震*

（1.青海省畜牧兽医科学院，青海大学，青海西宁 810016；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；3.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；4.河南省畜牧总站，河南郑州 450008）

1665 年Hooke 发现细胞，打开了从细胞水平认识生物个体的大门；1975 年Sanger 发明了第1 代基因测序技术，使人们能够从分子水平上探索细胞的遗传物质；21 世纪以来，人类基因组计划完成，人类对遗传物质的研究更进一步，测序技术也得到很大提高，但这些测序技术以及对细胞遗传物质的研究总是基于大量的细胞，所测得的数据为细胞群体的平均水平，无法获得精确的单个细胞的遗传信息，体现不出细胞间的异质性。2009 年，Tang 等在Nature Methods 杂志上初次发表了单细胞转录组测序的文章，开启了单细胞测序的大门。随着单细胞测序技术的发展，单细胞测序与动物遗传育种的联系越来越紧密，为家畜家禽的早期选种及生长性状的选择提供重要依据。本文对单细胞测序技术及其在畜禽遗传育种中的应用展开综述，以期为后续家畜家禽遗传育种的研究提供参考。

1 单细胞测序技术

单细胞测序技术包括单细胞样本的制备、单细胞分离技术、单细胞测序技术以及数据处理与分析。

1.1 单细胞样本制备 单细胞样本质量的好坏直接关乎到测序结果的准确与否，在单细胞测序中通常采用新鲜组织样本分离的细胞，以此避免离体组织缺血缺氧对细胞造成损害。首先对待测样本进行机械剪切，再根据样本的差别加入不同的酶处理，过滤掉没有被酶消化的大块组织，对细胞重悬，防止细胞聚集，影响测序结果。

1.2 单细胞分离与提取 随着科学技术的发展，单细胞分离提取方法已从原始的、低通量的连续稀释法发展为今天的具有高通量的荧光活化细胞分选技术、微流体技术等。连续稀释法是指在细胞悬液中不断稀释细胞群体，直至悬液中细胞个数仅为1 个或极少数时停止，该方法成本低廉，操作简便，但无法辨别细胞，且可能造成DNA 污染。显微操作法是在显微镜下通过观察细胞形态或细胞着色情况辨别细胞并分离，该方法的优点同连续稀释法，缺点为靠人眼辨识细胞易发生错误，且通量低。激光捕获显微切割技术（Laser Capture Microdissection，LCM）是在显微镜下选择要操作的细胞，利用激光捕获并分离细胞，为低通量的技术，可对用石蜡包埋、福尔马林固定的组织操作，缺点是激光容易损伤细胞及所含的遗传物质。荧光活化细胞分选（Fluorescent-Activated Cell Sorting，FACS）使 用荧光色素与细胞表面受体特异性结合，对细胞做标记，基于标记和激光对细胞选择，实现对细胞的高通量选择，不足之处在于此方法需要从大量的悬浮细胞中检测，对数量较少的细胞可能会造成损害以致结果不准确。磁活化细胞分选（Magnetic-Activated Cell Sorting，MACS）与FACS 差异之处在于以带有特异抗原的磁珠与细胞表面的受体结合，相比于FACS 作用时间更短，但不如FACS 特异性强。微流控技术（Microfluidic Control）是在1 个微芯片上集样本制备、细胞分离为一体，通过计算机控制细胞的分选，可以对细胞精确筛选，灵敏度高，通量高，由于使用芯片作为生物化学功能的集成，该技术成本较高。拉曼镊子技术（Raman Tweezers）是将光镊与拉曼显微光谱结合起来，光镊用于对单个细胞的固定，拉曼显微光谱用于检测细胞信息，这项技术对细胞无直接接触，不会损伤细胞，而且提高了对细胞的辨识能力。

1.3 单细胞测序

1.3.1 单细胞基因组测序 单细胞分离成功后，因为单个细胞的基因组DNA 含量过少，所以需要对基因组进行扩增，以便完成高通量的测序。目前已知对基因组扩增方法有基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术、多重置换扩增（Multiple Displacement Amplification，MDA）技术、多次退火环状循环扩增（Multiple Annealing And Looping-based Amplification Cycles，MALBAC）和转座子介导的基因组线性扩增技术（Linear Amplification Via Transposon Insertion）。

具体地，随机寡核苷酸引物PCR（Primer-extension Preamplification PCR，PEP-PCR）和退变寡核苷酸引 物PCR（Degenerate Oligonucleotide-primed PCR，DOP-PCR）都是将短片段引物随机结合在基因组上，在酶的作用下扩增。接头介导的PCR（Ligationmediated PCR）是先用限制性核酸内切酶剪切DNA片段，之后在DNA 片段末端添加扩增引物，随即扩增DNA。使用PCR 技术对基因组进行扩增有许多不足之处，非特异性扩增强，扩增效率低，扩增产物的基因组覆盖率低，不足10%。MDA 的扩增原理是链置换，使用DNA 聚合酶如phi29 和耐核酸外切酶的引物在DNA片段上随机结合并扩增，扩增产物取代原先的互补链成为新的模板，扩增产物为高相对分子质量的DNA。MDA 技术在恒温30℃下即可完成，具有较高通量，可获得大量扩增产物，phi29 聚合酶保真性好，全基因组覆盖率高。MALBAC 将PCR 技术和MDA 技术联合使用，前5 个循环使用Bst DNA 聚合酶完成MDA 部分，扩增产物两端加入互补序列形成环状结构，防止MDA的基因指数型增长，此后PCR 扩增，高温变性使环状链断开变为线性结构，大量扩增。MALBAC 技术既克服了PCR 技术错配率高的缺点，也克服了MDA 技术指数扩增基因组的不足之处，具有高通量，全基因组覆盖率达90%。转座子介导的线性扩增技术通过Tn5转座酶切开DNA，插入1 个T7 启动子，在体外条件下把DNA 转录为mRNA，再逆转录为cDNA，降低了扩增过程的错误率，全基因组覆盖度高达97%。

1.3.2 单细胞转录组测序 单细胞转录组的测序主要是将DNA 转录为mRNA 再逆转录为cDNA，对其进行扩增并测序，可以分为基于全长的测序和基于特殊分子标记的测序。基于全长的测序包括同聚物末端加尾法、Smart-seq、CEL-seq。同聚物末端加尾法和Smartseq都是利用多个单核苷酸聚合物捕获RNA，逆转录为cDNA 并扩增。CEL-seq结合体外扩增技术，在Oligo（dT）引物中添加T7 启动子，cDNA 合成后即可体外扩增。这些方法有通量低或错误率高的不足，而带有独特分子标记的测序则可解决这些问题。基于特殊分子标记的测序有STRT-seq 和Drop-seq，STRT-seq将分子标记与微流控技术结合，可对mRNA 的表达定量检测；Drop-seq是对每个cDNA 分子特殊标记并建库，可以进行高通量的测序。

1.3.3 单细胞蛋白质组测序 蛋白质组测序首次出现时间较晚，在2004 年由Nolan 和Dovichi 提出，Nolan 的方法是采用流式细胞仪技术分析细胞信号，构建信号网络。Dovichi 的方法侧重于化学细胞术，荧光标记蛋白质，毛细管电泳分离获得整个细胞的蛋白质指纹图谱。随着科技的发展，近几年对蛋白质组的测序方法也有了更新，如Proximity Ligation Assay for RNA（PLAYR）用不同探针和金属元素的同位素分别标记RNA 和蛋白质，用质谱流式细胞仪分析RNA 和蛋白质。Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing（CITE）用被寡核苷酸片段标记的抗体和磁珠特异性结合蛋白质和RNA，根据分子质量大小不同分离，测序分析RNA 和蛋白质。

1.3.4 单细胞表观遗传测序 表观遗传是指基因组DNA核苷酸序列不发生变化而基因、蛋白质的表达发生变化，导致表型改变的可遗传现象，包括DNA 甲基化，组蛋白乙酰化、甲基化等现象。单细胞表观遗传测序最早提出的方法是Hi-C 法，Hi-C 法是将染色质区域捕获（Chromosome Conformation Capture）与高通量测序技术（High-throughout sequencing）结合起来的技术，使用甲醛将DNA 与蛋白质键合交联从而稳定DNA 构象，之后经过酶切、加入生物素、酶连、提取一系列步骤，构建新文库、高通量测序，通过测序结果观察染色质间的相互作用。此外，亚硫酸盐测序法也是表观遗传测序中应用较多的方法，主要是对DNA 甲基化检测，亚硫酸盐使未甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，经过PCR扩增技术转为胸腺嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶不受此干扰。此种方法与新一代高通量测序结合，可以对全基因组的DNA 甲基化剖析。ATAC-seq是表观遗传组测序的一大提高，仅需要少量细胞就可以获知全基因组范围内的基因调控序列，实现开放性染色质测序，绘制染色质可及性图谱，显示染色质中各位点的位置；这种方法利用单细胞微滴制备系统分离细胞核并使其处于各微滴中，使用活性很高的Tn5 转座酶将细胞核中的核小体切割为很小的片段，测序分析。

1.3.5 多组学联合分析 对单个细胞的测序可以了解到该细胞的异质性及其在遗传内在机理中的差别，有些细胞数量少、不易捕获、在测序过程中会导致细胞损失，因而若对单个细胞进行多组学测序分析，则可以全面充分地了解到细胞信息和行为。目前具有代表性的多组学测序方法包括如下几种：DR-seq对DNA 和RNA测序，细胞裂解后同时扩增基因组DNA 和RNA，分离测序，但此种方法存在一定的不足，分离DNA 和RNA 时存在有分离不全的问题，导致测序结果不准确。G&T-seq也是对基因组和转录组的平行测序，通过带有短寡核苷酸链的磁珠分离RNA 和DNA，分别测序。scM&T-seq基于G&T-seq，对分离后的DNA 用亚硫酸盐测序甲基化，可以平行测序甲基化和转录组。3 组学测序方法为对细胞裂解物的上清液转录组测序，对裂解沉淀物基因组测序和甲基化测序；此外，scTrioseq可以对基因组、甲基化组、转录组平行测序，通过离心分离出细胞核，对细胞质选择性裂解，分离细胞质中的mRNA 与细胞核中的基因组DNA，可对基因组直接测序，也可以亚硫酸盐测甲基化。

1.4 数据处理与分析 单细胞测序后的原始数据首先应转化为FATSQ 格式，便于数据比对；其次要对数据有质量控制，基于FASTQC 执行数据质量检验，由QC值决定数据的好坏；第三对数据标准化，此步为数据处理部分中最重要的步骤，标准化是为消除在前面的实验操作中由非生物因素导致的数据偏差，如在样本制备过程中样本的损失、扩增偏差以及测序的不完整等。标准化后的数据分析应根据实验进行不同的设置，目前常用的有主成分分析法（Principal Components Analysis，PCA）和t-分布随机邻域嵌入法（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding，t-SNE），二者都可将高维数据降维处理，捕获细胞间的差别，不同之处在于PCA 无法将数据可视化，而t-SNE 则弥补了此不足。

2 单细胞测序技术的应用

单细胞测序技术近来在临床医学、微生物、神经科学、家畜育种等方面研究迅速，为研究的深入开展提供了理论和实践依据，本部分对近年来单细胞测序在家畜家禽育种上的应用展开介绍。

畜禽生产中，育种技术为核心技术，提高育种效率、缩短育种年限、对遗传资源的改良等都是育种过程中的关键问题。随着生物分子技术的发展，动物遗传育种与分子技术结合日渐紧密，全基因组育种、基因编辑育种、分子设计育种凸显出来，单细胞测序技术的应用更是为育种实践提供了新的技术方法。

2.1 在牛上的应用 有研究使用全基因组甲基化测序检测牛体内、体外囊胚细胞，以寻找体外胚胎生产技术与体内差异的原因，进而改进体外胚胎生产技术。该研究通过对体内、体外囊胚的单细胞全基因组甲基化测序，筛选出差异甲基化基因，从而改进体外胚胎生产技术，使其在引进优良品种、缩短育种进程、提高育种繁殖效率等方面发挥出巨大潜能。Soto 等用单细胞RNA测序技术、实时荧光定量PCR、免疫荧光分析对牛性腺发育过程中原始生殖细胞的分子特征做了研究，分析早期发育阶段原始生殖细胞的基因表达，阐释了牛原始生殖细胞的发育机制，并表明牛的生殖系和人类有相似性。

2.2 在猪上的应用 在猪上，对猪早期胚胎进行单细胞转录组测序，构建猪早期胚胎转录组图谱，发现众多还未进行功能研究的基因，可以扩大猪品种遗传资源，改良猪的重要性状。如有研究利用单细胞RNA 测序技术对瘦肉型猪和肥胖型猪的肌肉分析，发现在瘦肉型猪中具有比肥胖型猪明显多的肌系细胞，结合蛋白质组学分析，瘦肉型猪中的钙离子含量更少，研究显示钙离子含量少有助于维持肌系细胞的分化潜能，这2 个因素成为瘦肉型猪脂肪沉积少的重要原因，因此，根据单细胞测序技术能够发现控制猪优良性状的基因本质，可从DNA 上开展对猪的选育。

2.3 在羊上的应用 在绵羊上，有研究对小尾寒羊的产多羔基因进行卵巢相关单细胞转录组测序和蛋白质组学分析，筛选出相关的差异基因和差异蛋白，对这些基因进行功能验证，阐明多羔性状的分子遗传机制，为提高羊的繁殖效率、遗传性状改良及分子育种提供了理论基础。在山羊上，Yin 等通过单细胞转录组测序比较羔羊和母山羊成熟卵母细胞的基因表达，鉴定出1 086个差异表达基因，阐明了幼山羊的成熟卵母细胞在体外发育过程中不如成熟母山羊的卵母细胞发育良好的原因，为提高幼畜体外胚胎移植的效率提供了理论依据，对提升山羊的繁殖性能、缩短世代间隔具有重要意义。

2.4 在家禽上的应用 在肉鸡上，可以应用单细胞测序技术找寻影响肉鸡肌肉生长发育和脂肪沉积的相关基因，以此作为分子标记，对肉鸡进行辅助选育。有研究以京星黄鸡不同发育阶段（5 日龄和100 日龄）的胸肌组织中原代肌细胞和IMF 细胞为对象，应用单细胞RNA 测序技术，分析二者中的细胞组成及异质性，根据测序结果中基因表达的相似性分为成肌细胞群和脂肪细胞群，比较分析这两个细胞群，发现与肌肉生长发育、肌内脂肪代谢转运相关的基因，这些基因可作为分子标记对成肌细胞、IMF 细胞进行选择，为肉鸡肌肉生长、脂肪沉积等性状的选育提供帮助。

3 总结展望

单细胞测序技术是近年来发展较快、与生命科学领域结合紧密的一项技术，在医学方面为肿瘤、心脏疾病、肝脏疾病的研究与治疗做出了巨大贡献，如探究肿瘤细胞的微环境、分析肿瘤细胞的异质性为肿瘤疾病的治疗提供了理论基础；在育种方面，单细胞测序技术与植物育种和动物育种结合加快了分子育种进程。单细胞测序具有高通量、高精确度等特点，可在细胞水平上鉴定分析细胞行为、内在机制，可以检测新细胞，通过多组学联合分析可以获知细胞内复杂的相互作用机制，但单细胞测序技术还有一定的不足，如较高的成本，无法做到大规模大批量推广使用，且在单细胞样本的分离制备上有一定的难度，对于样本量较少、不易获取的细胞，若在实验过程中造成一定损失，则会导致所得数据不精确，故单细胞测序的各分步骤还有待完善。目前所有的单细胞组测序技术没有对microRNA、lncRNA 等非mRNA的检测，有些重要的功能也未发觉，这也是未来单细胞测序发展的重点。