基于网络药理学探讨大定风珠治疗帕金森病的作用机制

何亦婷，蔡灿佳，曾东禹，叶怡敏，李 平，林海玲，高分飞

（1．汕头大学医学院，广东 汕头515041；2．汕头大学医学院第二附属医院药学部，广东 汕头 515041)

帕金森病是一种常见的慢性退行性神经系统疾病，其主要症状为静止性震颤、肌强直、运动迟缓等[1]。帕金森病的发病机制可能与α-突触核蛋白聚集、线粒体功能障碍和多巴胺能神经元凋亡等有关[2]。过去20年，全世界的帕金森病患病率和发病率均迅速上升，随着人口老龄化的加剧，中国也处于帕金森病患病率急剧上升的阶段[3]。目前治疗帕金森病最有效的药物是复方左旋多巴，但只能用来改善症状，不能延缓疾病的发展。长期服用左旋多巴治疗，疗效逐渐变差，同时也出现运动障碍等不良反应[4]。帕金森病属于中医“颤证”范畴，《素问至真要大论》指出帕金森病的主要病变部位在“肝”，其基本病机为肝风内动[5]。临床研究[6]还表明，75%的帕金森病患者中医证型属于肝肾阴虚，因此治疗该病应以“滋养肝肾、熄风止颤”为根本原则[7]。

大定风珠源于清代吴鞠通《温病条辨下焦篇》，由生牡蛎、生龟板、鳖甲、阿胶、生白芍、生地黄、麦冬、五味子、火麻仁、生鸡子黄、炙甘草11味药组成，具有养阴潜阳、柔肝祛风的功效[8]，现代多使用于眩晕、颤症等病属于真阴亏耗者[9]。现代药理学研究表明，大定风珠可降低帕金森氏病蛋白7水平，提高神经生长因子-3水平，以对抗帕金森病患者过度氧化应激水平，避免神经细胞炎症损伤[10]。临床上也报道[9，11]大定风珠可用于治疗帕金森病，但缺乏系统的研究。中药成分的复杂性和功能作用的整体性提示，大定风珠可能通过多成分、多靶点、整体进行调节从而发挥重要作用[12]。本研究借助网络药理学探讨了大定风珠治疗帕金森病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 大定风珠靶点查找与筛选

在Herb数据库（http://herb.ac.cn/）查找大定风珠各组分的活性成分及作用靶点，并以Lipinski五规则[13]（分子量＜500；氢键给体数目＜5；氢键受体数目＜10；脂水分配系数＜5；可旋转键的数量＜10个）为标识筛选有效活性成分。通过Swiss Target Prediction数 据 库（http://www.swisstarget prediction.ch/）和Targetnet数据库（http://targetnet.scbdd.com/）得到具有生物活性成分的靶蛋白。通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）查询其蛋白所对应的人的基因，去除重复项后建立最终的中药作用靶点。

1.2 帕金森病相关靶点获取

运 用OMIM数 据 库（https://omim.org/）、Genecards数 据 库（https://www.genecards.org/）、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）进行帕金森病相关靶点的检索和筛选，去除重复项，汇总后建立最终疾病的靶点。

1.3 中药靶点和疾病靶点的交集

将生成的靶点导入到Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）网站，汇总交集有效成分靶点和帕金森病靶点，得出帕金森病相关靶点和大定风珠作用靶点的交集，即中药—疾病靶点，并绘制韦恩图。

1.4 中药—有效成分—靶点调控网络的构建

运用Cytoscape 3.8.2软件构建“中药—有效成分—靶点”互作网络。中药名称、药物活性成分和作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。

1.5 蛋白质—蛋白质相互作用网络构建

将从中药—疾病韦恩图中获得的交集基因导入STRING数据库（https://string-db.org/），将物种定义为“人”，绘制大定风珠治疗作用靶点蛋白相互作用网络图。

1.6 大定风珠治疗帕金森病关键靶点的获得

将得到的大定风珠治疗作用靶点蛋白交互作用网络图导入Cytoscape 3.8.2软件，进行蛋白评分。以参数自由度＞平均值为标准进行筛选[14]，若评分高于平均值且有相应研究的支持，则规定该基因为大定风珠治疗帕金森病的关键靶点。

1.7 GO与KEGG通路富集分析

使用R语言和Cytoscape 3.8.2软件将大定风珠对帕金森病具有治疗作用的靶点基因进行GO和KEGG通路分析。构建GO图和KEGG图，分析作用靶点基因GO功能和信号通路。

2 结果

2.1 大定风珠作用靶点和帕金森病相关靶点获取

通过Herb数据库查询大定风珠的化学成分，经过筛选之后，其所含化学成分数量如下：白芍7个、生地黄17个、麦冬32个、龟板6个、牡蛎1个、鳖甲1个、阿胶3个、甘草167个、五味子71个、芝麻12个、鸡子黄2个。与此对应的中药作用靶点1 120个。通过系统疾病靶点数据库（OMIM、Genecards、TTD），获得疾病靶点863个。

2.2 大定风珠—帕金森病互作靶点的筛取

大定风珠靶点和帕金森病靶点，取交集后得到大定风珠—帕金森病靶点共135个，见图1。

图1 大定风珠—帕金森病靶点韦恩图

2.3 中药—有效成分—靶点调控网络的构建

通过Cytoscape 3.8.2软件构建“中药—有效成分—靶点”调控网络，见图2和图3。从图中可看出同一靶点可对应不同的活性成分，也可对应相同的活性成分，这充分反映了大定风珠多组分、多靶点的作用特点。

图2 “中药（除甘草外）—有效成分—靶点”调控网络

图3 “甘草—有效成分—靶点”调控网络

2.4 蛋白质—蛋白质相互作用网络构建

将135个共同靶点导入STRING数据库中，构建大定风珠治疗帕金森病潜在靶点的蛋白质—蛋白质相互作用网络，相互作用关系见图4。

图4 大定风珠与帕金森病交集靶点的蛋白质—蛋白质相互作用网络

2.5 大定风珠治疗帕金森病关键靶点的获得

将获得的大定风珠治疗靶蛋白交互作用网络图导入Cytoscape 3.8.2软件进行分析，并使用网络分析插件进行网络拓扑分析，得到潜在靶点基因拓扑参数自由度、介度中心度和接近中心度，自由度表示节点所包含的边的数目，靶点自由度越大，表明通过该靶点发挥作用的可能性越大。结果，自由度＞8.5（平均值）的靶点有37个，其中与帕金森病相关的关键靶点有26个，见表1。

表1 大定风珠治疗帕金森病的26个关键靶点

2.6 GO功能富集分析结果

对大定风珠和帕金森病的共同靶点进行GO功能富集分析，根据P＜0.05确定了2 797个GO条目，其中涉及生物过程（biological process，BP）的条目2 481个，主要涉及化学应激、神经元死亡等方面；涉及细胞组成（cellular component，CC）的条目148个，主要涉及膜阀、膜微结构域、胞质囊腔等方面；涉及分子功能（molecular function，MF）的条目168个，主要涉及细胞因子受体、神经递质受体、淀粉样β蛋白等方面，推测大定风珠可能通过调节这些生物过程来起到治疗帕金森病的作用，见表2和图5。

图5 GO功能富集分析柱状图（P值排名前10）

表2 GO功能富集分析（P值排名前10）

2.7 KEGG通路富集分析结果

以P＜0.05进行筛选，得到293条信号通路，参与的主要通路包括cAMP信号通路、多巴胺能神经突触通路、细胞凋亡通路、Th17细胞分化通路、长寿调节通路、刺激神经组织的中的交互通路、含血清素的神经突触通路、酪氨酸代谢通路。表明大定风珠的有效成分可能通过作用以上通路来治疗帕金森病，见表3和图6。

表3 KEGG通路富集分析（P值排名前20）

3 讨论

利用现有数据库和网络药理学生物信息分析方法，筛选中药大定风珠治疗帕金森病的可能靶点和机制。通过对数据库的初步筛选，获得了319个可能的活性化学成分，预测了26个关键靶标。在蛋白质—蛋白质相互作用网络图中，治疗靶蛋白之间错综复杂的相互作用显示了大定风珠作用的多样性和复杂性。

研究表明，MAPK1的异常表达与神经元死亡有关[15]，这在帕金森病发病和进展中起着重要作用。此外，关键目标STAT3可调节星形胶质细胞增生[16]，APP可通过帕金森病脑区神经元淀粉样前体蛋白异常积累导致线粒体功能障碍[17]，EGFR可能在多巴胺能神经元细胞死亡中发挥重要作用[18]，FYN可通过以下途径参与帕金森病的发病机制，如调节α-突触核蛋白磷酸化、氧化应激诱导的多巴胺能神经元死亡、神经炎症和谷氨酸兴奋性毒性[2]。这表明本研究预测大定风珠治疗帕金森病的可行性。

GO分析的结果提示BP主要涉及化学应激、神经元死亡、突触传递、氧化应激等方面；CC主要涉及膜阀、膜微结构域、胞质囊腔、突触前膜、神经元胞体等方面；MF主要涉及细胞因子受体、神经递质受体、淀粉样β蛋白、离子通道、儿茶酚胺、蛋白酪氨酸激酶活性等方面，这与关键靶点分析相吻合。

通过KEGG富集结果以及查询文献可知，大定风珠治疗帕金森病主要通过cAMP信号通路、多巴胺能神经突触通路、Th17细胞分化通路等通路，对帕金森病的细胞多途径干预。在cAMP信号通路中，cAMP是中枢神经细胞的第二信使，对神经元的存活、发育、认知，以及树突、轴突的生长调节发挥重要作用；对星形胶质细胞等多种细胞功能有着调节作用。这对大脑内环境的稳态有重要的意义[19]。大定风珠的有效成分对神经元的作用可能是通过对内环境稳态、黑质的神经元进行发育和生存干预来实现的。多巴胺能神经突触通路涉及多巴胺在突触前轴突终末释放后作用等多种机制。多巴胺作为神经递质，调控运动、认知、奖赏机制、神经内分泌等多种功能。多巴胺与多种亚型受体结合，包含D1R（D1和D5受体）、D2R（D2、D3和D4受体），其调节腺苷酸环化酶、cAMP和细胞内钙离子的水平，对神经元的活动产生重要的影响[20]。而多巴胺的传递功能障碍与帕金森病的发生密切相关[21]。大定风珠的有效成分对神经元的作用可能通过促进多巴胺的生成和释放进行调控而发挥治疗作用。对Th17细胞分化通路而言，Th细胞的平衡分化对人体免疫等至关重要，有研究表明，Th17细胞介导的IL-17信号通路可诱导多巴胺能神经元凋亡。由Th17细胞分泌的IL-17与其受体结合，作用于多巴胺能神经元，导致核转录因子NF-kB的激活，进而导致神经退行性变[22]。

综上，本研究使用网络药理学方法对大定风珠的有效化合物、作用靶点、通路等进行综合分析，初步验证大定风珠的可能机制。通过对MAPK1、APP、EGFR、FYN等关键靶点和多条通路的预测分析，为临床药物的研发提供了相应的理论依据。