费城染色体阴性骨髓增殖性肿瘤患者非驱动基因突变分布及临床特征分析

赵一帆，林绍泽，陈怡佳，许林纯，邢学仰，陶红芳，苏永忠

（1．汕头大学医学院第一附属医院血液科，广东 汕头 515041；2．绵阳市中心医院血液科，四川 绵阳 621000）

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）是起病于多能造血干细胞层面的一组疾病的统称，主要表现为一系或多系血细胞数量和质量的异常，同时出现肝脾肿大、血栓或出血事件等临床表现[1]。临床上MPN主要包括真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）、原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）三种类型[2]。目前的研究[3-5]确定了JAK2、CALR、MPL三种驱动基因在MPN发病机制具有重要作用，超过95%的PV患者和90%的ET或PMF患者表达三种驱动基因突变中的至少一项，但约有10%的ET和PMF患者上述三种驱动基因突变均无法检测出，这类患者被称为“三阴性”突变型[6]。而随着近年来二代基因测序等检测手段的普及，多种非驱动基因突变在MPN患者中被发现，包括ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2在内的高危基因突变及TP53、TET2、DNMT3A等基因突变均被认为与MPN患者预后不良及白血病的转化有关[7-8]。本研究对123例初诊的MPN患者进行常见非驱动基因的检测，旨在了解MPN患者非驱动基因表达频率并分析其临床特征差异性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2018年1月—2020年12月于汕头大学医学院第一附属医院住院就诊的123例初诊MPN患者的临床资料，所有患者均符合2016年世界卫生组织制定的PV、ET、PMF诊断标准[2]。其中男性63例，女性60例，中位年龄58岁（17～85岁），其中PV、ET、PMF分别为31例、65例及27例。本研究经汕头大学医学院第一附属医院伦理委员会审查批准。

1.2 分析方法

采用病例回顾性分析方法，收集123例患者初次住院时的外周血常规、影像学、骨髓细胞学、骨髓组织病理、既往血栓病史等资料。所有患者均已通过二代测序的方式进行MPN相关28种基因突变检查。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行分析。正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析或独立样本t检验。非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距[M(Q1，Q3)]表示，组间比较采用Kruskal-WallisH检验或Mann-WhitneyU检验。计数资料采用卡方检验、Fisher精确检验法等方法检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

3组患者的性别构成、年龄及并发血栓事件例数差异无统计学意义（P值均＞0.05）。相比PMF和ET患者，PV患者具有更高的血红蛋白值（P＜0.001）和红细胞压积水平（P＜0.001）。ET患者则表现出更高的血小板计数（P＜0.001）。PMF患者的白细胞计数（P=0.021）、乳酸脱氢酶水平（P=0.022）相对更高，并且具有出更多的骨髓原始细胞数（P=0.011）和更严重的骨髓纤维化（P＜0.001），同时也更容易合并肝脏（P=0.004）或脾脏肿大（P＜0.001），见表1。

表1 MPN患者一般情况及临床特征

2.2 基因突变检出概况

在全部123例患者中，总共检测出21种共201项基因突变，平均每例患者表达（1.63±0.98）项基因突变。86.99%的患者至少检测出1种驱动基因突变（JAK2、CALR和MPL），68.29%的患者检测出JAK2基因突变，16.26%的患者检测出CALR基因突变，4.88%的患者检测出MPL基因突变，分别有2例和1例PV患者同时检测到JAK2/CALR和JAK2/MPL基因突变。在非驱动基因的检测中，52.85%的患者可检测到至少1种非驱动基因突变，其中、PV、ET和PMF组患者人均表达非驱动基因0（0，1）、1（0，1）、1（0，2）项，3组间差异具有统计学意义（P=0.029），两两比较时ET和PMF组人均表达非驱动基因数均多于PV组患者，差异有统计学意义（P=0.047，P=0.011）。见图1。

图1 123例MPN患者基因突变分布情况

2.3 MPN患者有无非驱动基因突变临床特征的差异性分析

对比可检测到≥1种非驱动基因突变和未检测到非驱动基因突变的两组患者临床特征可发现，表达非驱动基因突变的患者中女性占比更高（P=0.023），年龄更大（P=0.022），白细胞计数（P=0.016）更高，血红蛋白水平（P=0.010）、红细胞压积（P=0.014）、血小板计数（P=0.043）更低，同时伴有更高的乳酸脱氢酶水平（P=0.030），见表2。

表2 MPN患者有无非驱动基因突变临床特征分析

2.4 MPN患者有无高危基因突变临床特征的比较

在全部123例患者中，表达包括ASXL1、EZH2、IDH1/2、SRSF2在内的高危基因突变患者占比为20.33%，对比高危基因突变和未表达高危基因突变的两组患者，可发现高危基因突变的患者以女性为主（P=0.031），通常年龄更大（P=0.024），具有血红蛋白水平（P=0.021）、红细胞压积（P=0.037）、血小板计数（P=0.043）更低，同时乳酸脱氢酶水平更高、纤维化更严重的特点，见表3。

2.5 MPN患者有无TET2基因突变的临床特征差异性分析

PV、ET和PMF组分别有7例、13例和8例患者发生TET2基因突变，3组之间TET2基因突变的发生率差异无统计学意义。相比于无TET2基因突变的患者，发生TET2突变的患者具有更高的白细胞计数（P=0.001），更低的血红蛋白水平（P=0.047）、更高的乳酸脱氢酶水平（P＜0.001）及更严重的骨髓纤维化（P=0.021），同时也有更多患者出现脾脏肿大的临床特征（P=0.018），见表4。

表4 MPN患者有无TET2基因突变的临床特征分析

3 讨论

骨髓增殖性肿瘤存在极强的异质性，根据美国梅奥诊所一项纳入3 023例MPN患者的生存预后研究显示，PMF相比于PV、ET具有明显更短的中位生存时间[9]。而MIPSS70、MIPSS70 plus等预后分层系统下不同危险度的PMF患者中位生存时间相差最多可达到25.4年[10]。因此对于MPN患者来说，精准诊断及危险度分层对于患者治疗方案选择及预后判断十分重要。明确JAK2、CALR及MPL等驱动基因和ASXL1、TET2、TP53、SRSF2等非驱动基因在MPN患者的表达状态，利用基因突变结果，结合年龄、体质性症状、血细胞计数等因素综合判断预后危险程度，并据此选择有效的个性化治疗方式变得越来越重要[6]。

本研究86.99%的MPN患者检测出JAK2、CALR、MPL三种驱动基因突变中的一种，驱动基因检出率较国内其他研究[11]稍低，考虑与检测方法存在差异及样本量偏少有关。值得一提的是，在PV患者中，本研究分别检测出2例和1例患者同时表达JAK2/CALR和JAK2/MPL基因突变，这种现象在国内目前仅有少量个案报道[12]。

目前的研究显示，MPN患者中出现的非驱动基因突变已经超过50种[6，13]，可通过干扰DNA甲基化、修饰染色质、影响信号传导通路及转录过程等多种方式导致MPN的发生[14-15]。其中突变率较高并且对MPN患者预后具有指导价值的非驱动基 因 主 要 包 括TET2、ASXL1、TP53、SRSF2、EZH2、U2AF1及IDH1/2等[16-17]。本 研 究 发 现TET2、ASXL1、TP53的表达概率相对更高。发生非驱动基因突变的MPN患者以女性为主，并多伴随年龄更大、白细胞更高以及血红蛋白、血小板水平更低的临床特点。自2011年开始，研究报道表达EZH2、SRSF2、IDH1/2、RAS等基因突变的MPN患者可表现出更短的总生存时间及更快的白血病转化速度[18-20]。而在2014年，Tefferi等[21]研究发现，相比较于原有的血细胞计数、年龄、不良核型的预后指标，联合分析ASXL1和CALR基因的突变状态可更加有效地预测PMF患者预后，并证实ASXL1基因突变在患者预后中具有负性调控作用。随后Guglielmelli等[8]的研究指出，以ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2组成的高危基因突变能有效预测患者生存时间及白血病转化风险，对比无高危基因突变的患者，高危基因突变的患者总生存时间缩短超过一半；而白血病转化风险则增加3.3倍，并且随着高危基因突变表达数量增加而愈发明显。另外，发生高危基因突变的患者还反应出了更明显的体质化症状和更严重的骨髓纤维化程度[22]。本研究统计后发现相比无高危基因突变的MPN患者，高危基因突变的患者中女性占比更高，具有年龄更大，血红蛋白、血小板计数更低的特点，同时反应肿瘤负荷的指标如乳酸脱氢酶水平更高、纤维化程度更严重。此外，在随访中已发现2例高危基因突变的患者分别在确诊PMF 9、13个月后转化为急性白血病。

根据目前的研究显示，TET2是众多非驱动基因中发生突变频率最高的基因，在PV、ET和PMF患者中分别可达到7%～16%、19%～22%及10%～18%[18]，而在最终转化为急性白血病的MPN患者中，TET2基因的突变率可高达19%～28%[23]。本研究的MPN患者共检测出28例发生TET2基因突变，其在PV、ET和PMF患者中的突变率分别为22.58%、20.00%及28.57%，略高于国内外研究的结果。目前TET2基因突变在MPN的发病机制中的作用暂未明确。一项法国的研究[24]通过对存在ATG2B/GSKIP基因突变的患者及12个无症状携带者进行基因筛查及随访，发现75%的健康携带者出现早期克隆性造血的现象，MPN驱动事件的克隆性优势在1/2的病例中与TET2突变相关，在1/3的病例中与影响剪接和（或）RAS通路的突变相关，共同导致MPN的早期发展，主要是原发性血小板增多症，且具有高转化风险。也有研究[25]认为TET2基因突变对于造血祖细胞早期分化可与JAK2基因突变发生协同作用，使造血干细胞增加自我更新信号的应答，并向粒单核细胞分化倾斜。以上研究推测TET2突变后增强了造血干细胞自我更新的能力，并加速髓系细胞的分化程度，促进了MPN的起病[26]。有意思的是，Ortmann等[27]指出TET2与JAK2基因在患者病程中发生突变的顺序可能影响疾病发展方向，先发生TET2后出现JAK2基因突变的MPN患者更倾向于ET表型，反之则更倾向于PV表型。本研究中伴随TET2基因突变的患者更加容易出现白细胞升高、血红蛋白降低、脾脏肿大及骨髓纤维化的临床特征。

非驱动基因在MPN的发病中具有重要作用。也有研究[28]指出EZH2的突变缺失通过H3K27甲基化水平的降低，导致其他癌基因异常表达并进一步促进恶性肿瘤的发生。EZH2具有与JAK2突变协同诱导肿瘤产生的作用，在小鼠实验中，诱导出现EZH2和JAK2基因双突变的小鼠表现出了骨髓纤维化程度增加，红细胞分化受损，髓系祖细胞和巨核系祖细胞增殖并引起外周血中血小板和白细胞增多的典型MPN样表现[29]。Guglielmelli等[30]的研究发现EZH2基因突变在PMF患者中具有预后不良的作用，EZH2基因突变的患者在初诊时即出现更高的白细胞、原始细胞及巨脾等表现，在随访过程中无白血病转化时间及总生存时间均较无EZH2基因突变的患者缩短。在小鼠模型的动物实验中，SRSF2的表达会导致髓系细胞特别是巨核系细胞分化偏倚，B细胞的发育和成熟度受损，以及造血干细胞数量的减少，并且导致MPN的发生[31]。IDH1/2突变诱发恶性肿瘤的机制主要在于IDH1/2突变后增加了2-羟基戊二酸的产生并通过组蛋白去甲基化的过程，阻止可诱导的谱系特异性分化基因的表达导致分化受阻[32]。有研究[33]报道IDH1/2在白血病转化中的突变率明显高于慢性期MPN，这提示了IDH1/2突变对于MPN的白血病转化具有重要作用。同时IDH2突变的存在还被证明增强了SRSF2异常剪接基因的表达，进一步导致基因组不稳定并增加白血病转化风险，突显了不同突变之间的互相干扰。

综上所述，本研究发现表达了非驱动基因尤其是包含了ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2等高危基因突变的MPN患者多具有更重的肿瘤负荷，合并贫血、血小板减少的概率较高。结合相关研究可知，TET2、EZH2、IDH1/2、SRSF2基因的表达与MPN的发生发展息息相关。如能继续追踪发生非驱动基因突变的患者的预后，将能进一步明确非驱动基因突变对于MPN患者生存时间、血栓事件并发症等方面的影响，或许能起到指导分层诊治的作用。