蒙药蓝刺头对去卵巢骨质疏松大鼠BMD、PPARγ、MSCs源性脂肪细胞形态影响*

赵 军 刘 岩 李 昕 董重阳 田广芳 王雄耀 师建平常 虹 高小明 莫日根 王振华

(1.内蒙古自治区中医医院中医内科,内蒙古 呼和浩特 010020; 2.内蒙古医科大学附属医院中医科,内蒙古 呼和浩特 010050; 3.内蒙古医科大学中医学院,内蒙古 呼和浩特 010110; 4甘肃省中医院痹症科,甘肃 兰州 735000)

骨质疏松(Osteoporosis，OP)属蒙医经典文献“骨枯症”范畴。受“肾主骨生髓，髓养骨；肾虚骨枯髓减”等古医籍阐发，蒙医认为OP根本病因为肾虚。绝经后骨质疏松症(PMOP)因女性绝经后卵巢功能衰退所致，属高转换型OP。19世纪蒙医著作经典《观者之喜》记载：“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以补为主，补暖补精，而抑赫依过剩……”[1，2]。蒙药蓝刺头性凉，味苦，效轻、稀、柔、钝，可接骨愈伤、固骨质[3]。本实验观察了蒙药蓝刺头对去卵巢OP大鼠右侧股骨骨密度(BMD)、左侧股骨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)mRNA调节作用、骨髓充质干细胞(MSCs)源性的脂肪细胞形态变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药品、试剂 蒙药蓝刺头制剂由广州中医药大学科技产业园提供。强骨胶囊：北京岐黄制药有限公司，规格：0.25 g/粒，30粒/瓶，产品批号：188103，国药准字Z20030007。己烯雌酚片：合肥久联制药有限公司，规格：0.5 mg/片，产品批号：20180925，国药准字H34021250。RT-PCR检测主要试剂：TRizol(Invitrogen)，氯仿(Amresco)，无RNase水(康为试剂)，Reverse Transcriptase(Promega)，RNase inhibitor(Promega)，SYBR Mix(康为试剂)；HE染液；5%碱性美蓝溶液；PBS缓冲液。

1.1.2 实验动物 4月龄Wistar大鼠雌性84只，购于内蒙古大学实验动物中心，合格证号：SCXK(蒙)2002—0001。内蒙古医科大学基础实验楼病理实验室饲养，每笼12只，购回适应性喂养7 d左右。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、模型制备 将84只大鼠随机平均分7组[蓝刺头高剂量组、中、低剂量组及强骨胶囊组、己烯雌酚组、模型组、假手术组(以下分别简称高组、中组、低组、强组、己组、模组、假组)]。参考文献[4]行PMOP模型复制，假组不切卵巢只切卵巢周围少量脂肪，缝合创口后5 d，将大鼠阴道脱落细胞涂片确定造模成功(见图1、图2)，30 d后任意选取2只行子宫HE染色观察(见图3、图4)。

图1 雌鼠光镜下动情期阴道涂片(400×)

图2 雌鼠光镜下动情间期阴道涂片(400×)

图3 光镜下雌鼠假手术组子宫HE染色(400×)

图4 光镜下雌鼠模型组子宫HE染色(400×)

1.2.2 药物干预、标本采集 90 d后行药物干预灌胃给药。低组、中组、高组据人鼠体质量比、人鼠代谢速率比折算以6.875 mg/mL、13.750 mg/mL、27.500 mg/mL给药，临床等效剂量以低组为准，高组、中组、低组剂量比例为4∶2∶1。己烯雌酚0.0313 mg/mL，强骨胶囊23.438 mg/mL，均按有效成人量给药；生理盐水体积相应对假组、模组灌胃。终每组按9只计。采血离心；剖取双侧股骨，采用4%多聚甲醛固定。

1.2.3 骨密度仪右侧股骨BMD计量学指标分析 骨密度仪离体骨BMD测定。

1.2.4 采用RT-PCR法测定PPARγmRNA表达 按RT-PCR检测试剂盒说明书步骤测定左侧股骨PPARγ mRNA表达。

1.2.5HE染色方法检测右侧股骨头骨髓脂肪细胞截面面积、数量 (1)大鼠股骨脱钙、蜡块制备[5]：4%多聚甲醛将大鼠右侧股骨固定10 d，EDTA脱钙液配制 ，在 1000 mL 的烧杯中加入 186 g EDTA-2Na·2H2O，189.4 g Na2HPO4、10.6 g NaH2PO4，加水约700 mL，将烧杯放置于加热搅拌器上并通电，NaOH 20 g再入，搅拌加热至 65 ℃，透明澄清液体颜色，测定调节溶液pH值为8.0，总量1000 mL定容。锥形瓶中移入大鼠右侧股骨，脱钙液EDTA加入，液/骨体积比约4∶1，换液定时每2 d一次，25 ℃左右室温，脱钙连续20 d，针尖刺入股骨，畅通无阻则完全脱钙。蜡块制备，常规行免疫组化染色观察。(2)左侧股骨骨髓HE染色：梯度酒精脱水HE染色观察。每组大鼠取5张切片(n0)，每张切片随机选5个视野(n1)，光学显微镜观察各组染色情况，采用医学图像分析系统，光镜下骨髓脂肪细胞体积、数量定量(n2、n3)。

2 结果

2.1 骨密度计量变化 显微CT扫描大鼠右侧股骨近心端，测BMD示：模组与假组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)；中组、低组、假组、强组、己组与模组比差异有显著统计学意义(P<0.01)；高组与模组相比差异无统计学意义(P>0.05)；低组、中组、己组、强组、假组与高组比差异有统计学意义(P<0.05)；中组、低组、强组、己组、假组之间比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度计量结果比较

表1 去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度计量结果比较

组别鼠数BMD蓝刺头高剂量组120.197±0.017△蓝刺头中剂量组120.320±0.034*蓝刺头低剂量组120.315±0.028*强骨胶囊组120.313±0.027*己烯雌酚组120.390±0.013*模型组120.190±0.017假手术组120.425±0.019*

注：与假手术组比，△P<0.05；与模型组比，*P<0.01。

2.2RT-PCR测定左侧股骨头目标基因表达 测骨组织PPAR-γ2目标基因表达示：(1)与假组比，模组大鼠骨PPAR-γ2明显升高(P<0.05)。(2)与模组比，高组、中组、低组、强组、己组、假组PPAR-γ2明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与己组比，高组、低组骨PPAR-γ2表达降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；蓝刺头中剂量组骨PPAR-γ2表达与其比差异有统计学意义(P<0.05)。(4)与强组比，高组、低组骨PPAR-γ2表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)；中组与强组比较，PPAR-γ2表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 蒙药蓝刺头对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨PPAR-γ2表达的影响

2.3 各组大鼠右侧离体股骨头骨髓脂肪细胞截面面积、数量 右侧股骨头HE染色，观察MSCs源性的脂肪细胞形态变化，骨髓脂肪细胞体积、数量比较，模组与假组比差异有统计学意义(P<0.05)；中组、低组、假组、强组、己组与模组比差异有统计学意义(P<0.05)；高组与模组相比差异无统计学意义(P>0.05)；低组、中组、己组、强组、假组与高组比差异有统计学意义(P<0.05)；中组、低组、强组、己组、假组之间比差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图5。

表3 各组大鼠右侧离体股骨头骨髓脂肪截面面积、数量比较

图a：高组；图b：中组；图c：低组；图d：强组；图e：己组；图f：模组；图g：假组图5 各组大鼠右侧离体股骨头骨髓脂肪细胞体积、数量(400×)

3 讨论

OP骨微结构改变，全身骨量减少，骨脆性增加，骨折易发。OP包括原发、继发，原发最常见，多发生于绝经后中老年妇女，全身老年性改变在骨骼系统反映[5]。PPARs是核激素受体家族中受配体激活核内转录因子，归属于类固醇、甲状腺、维甲酸受体超家族。据蛋白结构、功能不同，PPARs可分为PPARa、PPARβ/δ和PPARγ3个亚型；据启动子结构和mRNA拼接方式的不同，PPARγ基因可分为为PPARγ1、PPARγ2、PPARγ3、PPARγ4 4种类型。PPARγ 是 PPARs 家族中最具有脂肪专一性的一员，它在脂肪组织和脂肪细胞系中表达水平最高[6,7]。骨髓间充质干细胞成脂分化、成骨分化是骨形成重要过程。去除卵巢后大鼠骨髓组织内可见有脂肪细胞增多，脂肪细胞体积较大，数量较多，密度有所增大，一定数量的脂肪细胞聚集在一起，之间相互挤压，呈圆形或多边形。本实验观察蒙药蓝刺头干预后，模组、高组、中组、低组、己组、强组股骨PPARγ表达差异，进一步分析药物干预下骨成骨、成脂分化能力，以明确其作用机制。实验表明蒙药蓝刺头在适当剂量可抑制去卵巢大鼠骨组织PPARγ表达，抑制骨髓脂肪细胞体积、数量，提高BMD，起一定抗骨破坏、保护骨作用。

综上，大鼠在去卵巢以后骨组织PPARγ表达增高，骨髓脂肪细胞体积、数量增高，BMD明显降低；蒙药蓝刺头可抑制骨组织PPARγ表达，抑制骨髓脂肪细胞体积、数量，效果同己烯雌酚、强骨胶囊相似，起有效抗骨破坏、保护骨作用，为蒙医“补暖补精-清镇赫依-固骨质壮骨”理论防治PMOP提供实验依据。