高效液相色谱串联质谱法检测阿奇霉素原料药及其制剂中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质*

郝丽娟，徐艳梅，高燕霞△，刘 峰，崔巧利

（1.河北省药品医疗器械检验研究院·仿制药质量控制与评价重点实验室，河北 石家庄 050227；2.石药集团中奇制药技术<石家庄>有限公司·河北省制技工程技术研究中心·新型药物制剂与辅料国家重点实验室，河北 石家庄 050035）

阿奇霉素是首个十五元环大环内酯类抗菌药物，化学名为9a-甲基-9-脱氧-9a-氮杂-9a-同红霉素A，由红霉素A经过肟化、贝克曼重排、还原、甲基化等一系列反应制备而成［1-2］，主要用于治疗呼吸道、软组织、泌尿系统疾病及皮肤感染等，疗程短，副作用少［3］。基因毒性杂质是可以造成基因突变或体内诱变的物质，痕量即可引起癌变、畸变［4］。缬沙坦、雷尼替丁、二甲双胍中先后检出N-亚硝胺类基因毒性杂质，《世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单》已将多个N-亚硝胺类化合物归为A类致癌物质。其产生的原因可能与工艺过程、降解途径、污染引入等有关［5-6］。阿奇霉素的11位糖环上存在二甲胺基结构，是典型基因毒性杂质的警示结构，且原料药的合成过程存在亚胺类中间体，易通过氧化等途径引入基因毒性杂质［7-8］。起始原料红霉素A和阿奇霉素注射剂中均检出亚硝胺类基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺（NDMA）［9-10］。我国为全球重要生产国和出口国，国家药品监督管理局网站公布的600多种阿奇霉素药物的注册申报和出口都需要对其N-亚硝胺类杂质进行研究，但目前未见关于检测阿奇霉素药物中N-亚硝胺类杂质的相关研究。参照各国药品监管机构发布的N-亚硝胺类基因毒性杂质的通用检查方法［11］并参考文献［12-14］，本研究中建立了测定阿奇霉素原料药及其制剂中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质的高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）法，方法灵敏度高、结果准确，为有效控制阿奇霉素及其制剂中的基因毒性杂质提供了依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-30AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SCIEX ATRAP 6500型质谱仪（美国AB公司）；XS105型电子天平（瑞士Mettler Toled公司，精度为十万分之一）；Milli-Q型纯水制造系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

NDMA对照品（TMstandard公司，批号为1681903，含量以99.9%计）；N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）对照品（批号为51-KFA-33-1，含量以100%计），N-亚硝基二乙胺（NDEA）对照品（批号为50-GHZ-66-1，含量以100%计），均购自加拿大TRC公司；N-亚硝基乙基异丙胺（NEIPA）对照品（批号为D10252828，含量以100%计），N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）对照品（批号为D10252827，含量以100%计），N-亚硝基二丁胺（NDBA）对照品（批号为D10252829，含量以100%计），均购自HIC公司；甲醇（色谱纯，德国默克股份有限公司）；水为超纯水。抽检样品：阿奇霉素（原料药，批号分别为108200513，108200514，108200518）；阿奇霉素肠溶片（批号为FAR2901005）；阿奇霉素胶囊（批号为21012001）；阿奇霉素干混悬剂（批号为207210201）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 3 C18-AR柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：0.6 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.1.2 质谱条件

电离模式：正离子；离子源：大气压化学电离（APCI）源；监测模式：多反应监测（MRM）；中性（NC）电流：3 mA；气帘气（CUR）：206.8 kPa；雾化气（GS1）：241.3 kPa；离子源温度：350℃。6种N-亚硝胺类基因毒性杂质的保留时间及质谱分析参数见表2。

表2 6种N-亚硝胺类基因毒性杂质的保留时间及质谱分析参数Tab.2 Retention time and HPLC-MS/MS parameters of the six N-nitrosamine genotoxic impurities

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取6种N-亚硝胺类基因毒性杂质对照品适量，精密称定，加水稀释并定容，制成NDMA，NMBA和NDEA，NEIPA，NDIPA，NDBA的质量浓度分别为265 μg/mL和960 μg/mL的混合对照品贮备液。取上述混合对照品贮备液各适量，用水逐级稀释制得系列质量浓度的混合对照品溶液（NDMA和NMBA的系列质量浓度分别为48.00，24.00，4.80，2.40，0.96，0.48 ng/mL，NDEA，NEIPA，NDIPA，NDBA的系列质量浓度分别为13.25，6.62，1.33，0.66，0.26，0.13 ng/mL）。

供试品溶液：取原料药0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水5 mL，涡旋5 min，用水稀释并定容，振摇10 min，以4500 r/min的速率离心10 min，制成质量浓度为50 mg/mL的溶液，滤过，取续滤液，即得原料药供试品溶液。取样品（或内容物）20片（或粒、袋）研细，混匀，取细粉适量（约相当于阿奇霉素0.5 g），精密称定，置10 mL容量瓶中，加水5 mL，涡旋5 min，用甲醇稀释并定容，振摇10 min，以4500 r/min的速率离心10 min，滤过，制成质量浓度为50 mg/mL的溶液，取续滤液，即得制剂供试品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取空白溶剂及2.2项下混合对照品溶液、原料药供试品溶液、制剂供试品溶液，按2.1项下条件进样测定。结果6种N-亚硝胺类基因毒性杂质均无干扰峰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 专属性试验高效液相色谱串联质谱图1.NDMA 2.NMBA 3.NDEA 4.NEIPA 5.NDIPA 6.NDBAA.Blank solvent B.Mix reference solution C，D.Test solution（azithromycin API and its preparations，respectively）Fig.1 HPLC-MS/MS chromatograms of the specificity test

线性关系考察、检测限和定量限确定：取2.2项下系列质量浓度的混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱与质谱条件分别进样测定，记录色谱图。以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果表明，NDMA，NMBA和NDEA，NEIPA，NDIPA，NDBA质量浓度分别在0.48～48.00 ng/mL和0.13～13.25 ng/mL范围内与峰面积线性关系良好。分别以混合对照品溶液信噪比（S/N）为3∶1和10∶1的质量浓度为检测限与定量限。结果见表3。

精密度试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱与质谱条件平行测定6次。结果见表3，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取2.2项下系列质量浓度的混合对照品溶液，分别于室温放置0，1，2，3，6，10 h时按2.1项下色谱与质谱条件进样测定。结果见表3，表明对照品溶液在室温下放置10 h稳定性良好。

重复性试验：取原料药样品（批号为108200513），依法平行制备供试品溶液6份，分别量取对照品溶液适量，同法制备加标供试品溶液，按2.1项下色谱与质谱条件进样测定。结果见表3，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取原料药样品（批号为108200513），按2.2项下方法制备供试品溶液，共9份，分别精密加入2.2项下混合对照品溶液适量，制备成高、中、低3个质量浓度，各3份，按2.1项下色谱与质谱条件进样测定，并按外标法计算加样回收率。结果见表3，表明方法准确度良好。

表3 方法学考察结果Tab.3 Results of the methodological investigation

耐用性试验：更换流动相流速（0.4，0.8 mL/min），起始柱温（35，45℃），流动相B起始比例（0，4%）、不同品牌色谱柱进行测定。结果显示，小范围的改变测定条件，色谱峰峰面积变化不大，表明方法耐用性良好。

强制降解试验：取原料药样品（批号为108200513）4份，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进行强酸、强碱、氧化和加热（乙腈溶解，沸水浴）破坏试验，按2.1项下色谱与质谱条件进样测定，结果降解产物中均未检出6种N-亚硝胺类基因毒性杂质。色谱图见图2。

图2 强制降解试验高效液相色谱串联质谱图A.Strong acid damage B.Strong alkali damage C.Heating damage D.Oxidation damageFig.2 HPLC-MS/MS chromatograms of the forced degradation test

2.4 样品检测

分别取3批（批号分别为108200513，108200514，108200518）阿奇霉素原料药和3批（批号分别为FAR2901005，21012001，207210201）阿奇霉素制剂，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱与质谱条件进样测定。结果3批阿奇霉素原料药和3批制剂中均未检出6种N-亚硝胺类基因毒性杂质。

3 讨论

3.1 提取方法选择

以各成分的提取率为指标，考察了甲醇、乙醇、水、50%甲醇等提取溶剂及前处理方法，最终选择水作为溶剂，前处理方法采用先涡旋后振摇、再离心，以提高各成分的回收率。

3.2 色谱条件选择

考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流动相系统，结果以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相时，各成分色谱峰峰形及分离度均良好，12 min内可完全洗脱。

考察了Waters XBridge C18柱、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱、XSelect HSS T3柱、ACE Excel 3 C18-AR柱等色谱柱，结果以ACE Excel 3 C18-AR柱为色谱柱时，各成分色谱峰峰形良好，分离度较高。又通过对柱温及梯度洗脱程序的调整，进一步提高了分离效率，最终确定2.1.1项下色谱条件。

3.3 方法评价

阿奇霉素与敏感微生物的50s核糖体的亚单位结合后，对其蛋白质的合成产生干扰，体外试验和临床研究均表明，阿奇霉素对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌需氧致病菌有良好的抑菌效果，临床用途广泛。其分子中含有伯胺、仲胺结构，具有典型基因毒性致癌物的警示结构，在制备和储藏过程中易产生N-亚硝胺类杂质。本研究中建立了测定阿奇霉素原料药及其制剂中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质的HPLC-MS/MS法，强制降解产物中均未检出这6种杂质，推测此类基因毒性杂质为工艺杂质，应对原料生产的各个环节和步骤进行严格控制。方法学考察结果表明，所建立的方法操作简便、灵敏度高、结果准确、重复性好，可用于生产企业及药监系统日常检查，监测阿奇霉素原料药及其制剂中的N-亚硝胺类基因毒性杂质。