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斑马鱼肝脏组织油红O 染色方法比较优化

2022-10-11赵方新陆景坤武建强

医学信息 2022年17期
关键词:油红脂滴苏木

赵方新,李 怡,张 烜,陆景坤,牛 燕,丁 枫,武建强

(内蒙古医科大学基础医学院医学实验中心,内蒙古 呼和浩特 010110)

斑马鱼作为动物疾病模型相较于传统的啮齿动物模型具有独特优势,已广泛应用于医药卫生、毒理检验以及环境科学等众多领域[1]。斑马鱼肝脏的细胞表型与哺乳动物高度相似,拥有相同的功能,包括胆汁分泌、糖原和脂质储存、胰岛素反应、异种物质和氨代谢等[2],因此众多学者利用斑马鱼作为动物模型在肝病、肝功能等方面进行研究。油红O(Oil Red O,ORO)属于偶氮染料,具有很强的脂溶性和染脂性,在脂类中的溶解度比在溶剂中大,可与甘油三酯结合呈小脂滴状,滴于冰冻组织切片时油红O 溶于组织内的脂质(脂滴)中,使其呈橘红色,因此油红O 染色技术可以用来鉴定肝脏组织脂肪沉积情况,具有细胞定位功能作用,有助于判断及定性疾病[3,4]。斑马鱼脂肪肝病模型日渐成熟,冰冻切片油红O 染色技术更是研究脂肪性肝病的必要选择,但因斑马鱼肝脏结构与常用啮齿类动物差别大,体量微小,质地薄软,使用油红O 染色时斑马鱼肝组织的前处理以及切片厚度、染色时间以及步骤尚无统一标准。为了今后科研工作中斑马鱼肝脏疾病模型鉴定和研究提供技术参考,本研究利用斑马鱼肝组织冰冻切片,以探索不同前处理步骤、切片厚度、染色时间等条件下,最佳的斑马鱼肝脏组织油红O 染色方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 野生AB 型斑马鱼,3 月龄,上海费曦生物科技有限公司;4%多聚甲醛,Biosharp;异丙醇等,天津市鑫铂特化工有限公司;油红O,苏木素染液,甘油明胶封片剂,北京索莱宝科技有限公司;OCT 包埋剂,日本樱花;粘附载玻片,盖玻片,江苏世泰实验器材有限公司;冷冻切片机,台式显微镜等由内蒙古医科大学医学实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 染色液以及脱水溶液的配置 ①油红O 染色液:称取油红O 粉末500 mg 溶于100 ml 异丙醇适度震荡制成油红O 饱和储备液。实验前取适量储备液与ddH2O 制成60%染色液。染色前用0.42 μm 针式有机滤器进行过滤后得到实验染色液[5](2 h 内使用);②蔗糖脱水液:称取10 g(20 g,30 g)蔗糖溶解于100 ml 纯水中,4 ℃备用。

1.2.2 取材 3 月龄野生AB 型斑马鱼,禁食3 d 冰水浴处死,沿斑马鱼泄殖孔向前剪开小口,浸入4%多聚甲醛,4 ℃过夜,第2 天将斑马鱼固定于台式显微镜下,取出肝脏部分浸泡在4%多聚甲醛4 ℃过夜。次日取出,浸入10%蔗糖溶液,组织沉底后转入20%蔗糖溶液,直至在30%蔗糖溶液完成脱水。略吸去水分,OCT 包埋,放入-80 ℃冰箱。

1.2.3 切片 适当修块,肝脏组织露出后,设置不同厚度连续切片,粘附载玻片粘取切片。

1.2.4 染色 晾片:染色前冷冻切片在室温晾干(1 h 或无水气即可)。前处理:切片浸泡在4%多聚甲醛中固定10 min(或不固定)。油红O 染色:将切片平放在湿盒中并滴加足量的油红O 染色液(经0.22 μm 针式滤膜过滤器滤过),合盖停留不同时间(5、10、15 min)。分化:75%酒精、60%异丙醇分化2 s 后ddH2O 漂洗5 s,或直接ddH2O 浸洗30 s。苏木素染色:切片置于苏木素中停留不同时间(1、3、5 min)。漂洗:ddH2O 浸泡30 s 去浮色。1%盐酸酒精分化2 s,流水冲洗2 min返蓝。甘油明胶封片。将切好的冷冻切片分为四组,每组内切片来源于同一组织块。厚度组包含6、8、10、12 μm 四种不同厚度各2 片;其他各组切片厚度均为8 μm,每种不同的处理方法处理2 张切片。

1.3 观察指标 观察成片后显微镜视野内(×200 和×400)组织情况,判断有无明显裂痕缺损脱片,橘红色脂滴染色是否清晰、细胞边界是否明显,整体背景染色情况以及是否可以分辨出深染的细胞核。

2 结果

2.1 切片厚度选择 切片机分别设置6、8、10、12 μm,做同样连续切片,后执行相同的处理步骤。切片厚为5 μm 时,组织脱片以及破裂程度较大,不完整;厚度为8 μm 和10 μm 时,视野中基本没有脱片和破损,无残留背景,细胞中间有深染的细胞核,细胞内脂滴呈橘红色,定位清楚,二者没有明显差异;当厚度为12 μm 时,细胞结构模糊,脂滴不清晰,见图1。因此,斑马鱼肝脏冷东切片的适宜厚度应设置在8~10 μm。

图1 不同厚度的斑马鱼肝脏冷冻切片的油红O 染色效果比较(×200)

2.2 染色前处理设置 取8 μm 的切片分组行不同染色前处理。室温晾干1 h,经4%甲醛固定10 min 后染色的切片,200 倍视野下组织基本完整,无脱落、破裂的情况,染色定位清晰,效果满意。室温晾干1 h后无甲醛固定步骤染色的切片,组织轻度脱落、破裂,有均匀分布的空洞,可能影响最终对于脂滴的的判断。而仅室温晾到无水气的切片,无论有无甲醛固定步骤,都有较为明显的脱片现象,见图2。

图2 斑马鱼肝脏冷东切片不同染色前处理效果比较(×200)

2.3 油红O 染色时间与分化方法的选择 取8 μm的切片执行不同的染色时间(8、10、15 min),每组内用不同的分化液(75%乙醇、60%异丙醇、ddH2O)处理。当油红O 染色5 min 时,油红O 着色均较浅(图3A、3B、3C)。染色10 min 时,经过75%乙醇、60%异丙醇分化后,镜下可见组织切片中的脂质被油红O染成橘红色(红色),细胞核为蓝紫色,无背景残留(图3D、3E),ddH2O 分化30 s 的背景残留多(图3F),可见ddH2O 无法洗脱残留油红O。相比而言,同一组织的切片,60%异丙醇分化后的脂滴更多,75%酒精分化的脂滴相对更少,75%酒精对脂质的洗脱力更强。染色时间延长至15 min 时,三种分化方法均背景着色严重(图3G、3H、3I)。因此,油红O染色10 min 后使用60%异丙醇分化效果最好。

图3 不同染色时间与不同分化方法的效果比较(×200)

2.4 苏木素染色时间比较 取8 μm 切片,苏木素染色时间设置为1、3、5 min,其他步骤相同。苏木素染色1 min 时(图4A、4D),细胞核染色过浅,边缘模糊不清;苏木素染色3 min 时(图4B、4E),细胞核呈深浅适宜的蓝紫色,轮廓清晰;苏木素染色5 min 时(图4C、4F),细胞核着色加深,油红O 着色有所减少,因此苏木素在斑马鱼肝脏冷冻切片的油红O 染色中设置为3 min 较为适宜,见图4。

图4 斑马鱼肝脏冷冻切片的油红O 染色中苏木素染色时间的效果比较

3 讨论

近年来,各类型斑马鱼疾病模型以及转基因斑马鱼品系日渐完善,也因其成模快、价格便宜、养殖要求低等独特的优势被越来越多的研究团体和人员使用[6-9]。在研究肝脏疾病、相关药物筛选和评价等方面亦是如此,斑马鱼肝脏在细胞、功能、信号传导以及疾病的细胞过程等方面与人类十分相似[10-12],在基因、蛋白水平上也与人类也具有高度保守性,这使斑马鱼成为研究人类肝脏疾病基本机制的良好工具。

油红O 染色法因其性价比高和操作相对简单,是病理诊断和科研的常用方法,在肝脏疾病,尤其是脂肪性肝病的研究中是必不可少的[13-15]。但与小鼠等动物的肝脏相比,斑马鱼肝脏[16-17]薄而狭长,分为三叶,包绕在肠道外,结缔组织极少,上述特点决定斑马鱼肝脏的质地较为软且脆,因此适合于哺乳动物肝脏冷冻切片油红O 染色法并不完全适用于斑马鱼肝脏。另外斑马鱼肝脏组织在新鲜状态下不易剥离,经过实验发现将延泄殖孔向前剪开5 mm 左右在4%多聚甲醛中浸泡数小时后再进行解剖更易操作,此时经过固定后的肝脏较硬且形状固定,可以剥出完整的肝脏组织。OCT 包埋时应根据需要调整位置保证切片时能切到较大面积的肝实质。一般而言,实验结束会收取较多样品组织,不可能在短时间内完成切片以及染色等全部步骤,需要冷冻储存。本实验发现,不经脱水固定的斑马鱼肝脏样品组织冷冻后再切片会有较大孔洞,且容易出现褶皱破损,这可能与冷冻中产生的冰晶有关[18],因此包埋前应进行10%~30%蔗糖溶液梯度脱水,一般遵循组织块沉底后转入下一梯度,完成脱水后直接OCT 包埋可储存在-80 ℃冰箱中随时取用。因组织块较小,OCT包埋时应根据需要调整位置保证切片时能切到较大面积的肝实质。当一次性切取较多冷冻切片时,可以将切片保存在-20 ℃冰箱里,经过脱水固定处理的组织切片可以保存较长时间,不影响后续染色效果。根据实验结果,冰箱中的切片在染色前应提前在室温彻底晾干复温1 h,否则易出现脱片破裂等情况。据研究报道[19],油红O 染色步骤说法不一且少有针对斑马鱼肝脏的处理方法。本次实验设置不同厚度、不同染色前处理、不同染色时间、不同分化液,对比显微镜下效果,得到适合于斑马鱼肝脏的处理步骤:切片厚度8~10 μm,室温晾干1 h,甲醛(4%)固定10 min,油红O 染色湿盒滴染10 min,60%异丙醇分化2 s,ddH2O 浸洗浸泡5 s 后,苏木素染色3 min,ddH2O 浸泡30 s 去浮色,1%盐酸酒精分化2 s,流水冲洗2 min 返蓝,甘油明胶封片。此方法步骤简单,耗时短,切片染色效果好,可快速简便的获得满意的斑马鱼肝脏冷冻油红O 染色片。

综上所述,本次优化的斑马鱼油红O 染色方法可以较为清晰地显示肝脏脂滴,可辨别细胞核轮廓位置,进而对斑马鱼肝病模型中的脂肪变性情况进行定位与半定量的分析。

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