青海省养殖三倍体虹鳟呈味核苷酸和挥发性风味物质的研究

张素珍，励建荣，刘小红，田海宁，孟玉琼, ，马 睿,

（1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；2.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州 121013；3.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海西宁 810016；4.青海大学生态环境工程学院，青海西宁 810016）

青海省水域面积达2050 万亩，宜渔面积有82.3 万亩，丰富、优质的冷水资源为青海省冷水鱼养殖产业提供了优越条件，被誉为“冷水鱼的天堂”。近年来青海省冷水鱼养殖产业快速稳步发展，目前全省网箱养殖面积约33 万平方米。虹鳟（）是鲑鳟鱼的一种，隶属鲑形目、鲑科、大麻哈鱼属，是一种适应性很强的冷水鱼，自1959 年引进中国，目前已在中国20 多个省（市）进行养殖，是世界上最重要的水产养殖物种之一。因三倍体虹鳟不育、生长快的特性，经济价值优于二倍体虹鳟，青海省以三倍体虹鳟为主要鱼种进行深水大网箱养殖，鲑鳟鱼网箱养殖产量已达1.5 万吨，占全国总产量的30%以上，青海已成为全国最大的鲑鳟鱼网箱养殖基地，具有研究国产虹鳟鱼的代表性。

虹鳟鱼不仅营养价值高，而且具有丰富的口感风味，深受消费者喜爱。鱼肉风味主要有滋味和气味两部分构成，是食物刺激味觉和嗅觉受体而产生的综合性反应，鱼肉中的呈味核苷酸已广泛用于滋味评价，鱼死后其体内的三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）发生降解，生成一系列产物，其中对鱼肉滋味有主要贡献的是肌苷酸（Inosincacid，inosine monophosphate，IMP）和一磷酸腺苷（Adenosine monophosphate，AMP），是鱼类重要的呈味核苷酸类物质。气味也对鱼肉整体风味起着重要作用，主要由挥发性化合物产生，这些化合物由酶反应、脂质氧化以及微生物作用等产生。

青海省有着独特的地理条件，孕育了得天独厚的高原水域环境，不同的养殖环境因环境因素差异较大会对鱼肉品质产生极大影响。然而关于青海省内不同地理分布养殖虹鳟鱼风味是否存在差异缺乏系统研究。黄河上游以龙羊峡为界设有多个水库，其中龙羊峡、拉西瓦和公伯峡，其地理位置从上往下，是青海省主要的冷水鱼养殖地，因此，本研究选取青海省龙羊峡、公伯峡和拉西瓦水库养殖的商品虹鳟鱼为对象，通过滋味物质和挥发性气味物质的测定研究，对青海不同产地的养殖虹鳟风味进行评价分析，以期为三倍体虹鳟鱼风味的深入研究提供参考依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

体重为3.5 kg 左右的冰鲜三倍体虹鳟 购自于青海龙羊峡、公伯峡和拉西瓦水库的养殖公司，每个地区取12 尾，带回实验室放入-80 ℃冰箱中保存待测；2,4,6-三甲基吡啶、ATP、二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate，ADP）、AMP、IMP、次黄嘌呤核苷（Inosine，Ino）、次黄嘌呤（Hypoxanthine，Hx）标准品 美国Sigma 公司；其他试剂 分析纯，上海国药集团化学试剂公司。

ME204E 电子天平 上海梅特勒-托利多公司；XHF-D 内切式匀浆机 宁波新芝生物科技公司；Centrifuge 5418 高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Agilent 1260 高效液相色谱仪 美国Agilent公司；GCMS-QP2020 气相色谱-质谱联用仪（配有自动固相微萃取SPME 系统） 日本Shimadzu 公司；CAPCELL PAK CAQ S5 色谱柱（4.6 mm×250 mm）日本资生堂。

1.2 实验方法

1.2.1 核苷酸测定

1.2.1.1 样品处理 参考Ma 等的方法，取背部鱼肉1 g（精确0.0001 g）加入5 mL 0.6 mol/L 的HClO溶液匀浆。离心10 min（4 ℃，3000 r/min）后取上清液，重复上述步骤三次。合并提取液于10 mL 容量瓶，用0.6 mol/L HClO定容，然后用1 mol/L KOH调pH 为6.5～6.8。静置30 min 后，过滤到25 mL 容量瓶内，并用0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7）定容。过0.22 μm 膜待测。

1.2.1.2 检测条件 色谱柱为CAPCELL PAK CAQ S5 柱（4.6 mm×250 mm），流动相为0.04 mol/L 磷酸二氢钾和0.06 mol/L 磷酸二氢钾的混合液（v:v=1:1,pH7），流速为1 mL/min，柱温40 ℃，进样体积为5 μL，在260 nm 处进行紫外吸收检测。

1.2.1.3 定性、定量方法 用标准品定性，相应的标准曲线定量，如表1。根据公式（1）、（2）计算K 值和Ki 值：

表1 核苷酸标准曲线方程Table 1 Nucleotide standard curve equation

滋味活性值（Taste Activity Value，TAV）是评价单个滋味物质对食品滋味的贡献大小，当呈味物质的TAV 值大于1 时，该呈味物质对样品的呈味有贡献，其值越大，贡献越大。根据公式（3）计算TAV：

式中：C 为滋味物质的绝对浓度值；T 为该物质阈值。

1.2.2 挥发性气味物质测定

1.2.2.1 样品处理 参考Ma 等的方法，顶空小瓶中加入3 g 鱼肉和4.5 mL 饱和氯化钠溶液，匀浆后加入15 μL 91.7 ng/μL 的2,4,6,-三甲基吡啶稀释液作为内标。萃取头穿透顶空进样瓶盖，在样品上方吸附萃取35 min 后，将萃取头插入气相-质谱仪进样口，在高温下解析5 min 后分析测定。

1.2.2.2 GC-MS 检测条件 色谱柱：Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：35 ℃保持3 min，以10 ℃/min 的速度升到200 ℃，再以20 ℃/min 从200 ℃升至260 ℃并保持8 min；载气（He）流速1.5 mL/min，进样器为无分流工作模式电子轰击离子源，离子源的温度为230 ℃，接口温度为280 ℃，四级杆温度为150 ℃，质量扫描范围为30～500 m/z。

1.2.2.3 定性、定量方法 各挥发性化合物通过（NIST 17.0）光谱数据库确认定性，取相似度80%以上者的结果。使用2,4,6-三甲基吡啶作为内标进行半定量测定。通过比较每种化合物的峰面积与内标的峰面积，对样品中挥发性醇、醛、酸、碳氢化合物和芳香化合物进行定量，单位为ng/g 肌肉（湿重）。按照公式（4）计算挥发性成分浓度：

式中：C为未知挥发性成分浓度；C为内标浓度；A为未知挥发性成分峰面积；A为内标峰面积。

关键气味化合物的筛选：采用气味活度值法（odor activity value，OAV）筛选出虹鳟鱼肉的气味活性物质（气味活度值OAV≥1），OAV 按照公式（5）进行计算。

式中：C 为挥发性气味物质的相对浓度；T 为挥发性气味物质的阈值；OAV 值越大，说明该物质对总体风味贡献越大。

1.3 数据处理

采用SPSS 25 对所得数据进行统计分析，其中采用单因素方差分析（One-way ANOVA）对数据进行分析，当差异显著时（＜0.05）采用Tukey's 检验进行多重比较，实验结果以平均值±标准误（Mean±S.E.M）表示。对三个产地养殖虹鳟鱼的所有气味物质和核苷酸在Origin 2021 中标准化处理数据后采用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 肌肉核苷酸

不同产地虹鳟鱼肌肉核苷酸物质对比见表2，三个产地虹鳟鱼肉的ATP 和Ino 含量无显著性差异（＞0.05），龙羊峡养殖虹鳟鱼的ADP、AMP、IMP和Hx 含量显著低于其他产地组（＜0.05），K 值和Ki值拉西瓦产地组显著高于龙羊峡产地组（＜0.05）。从表3 可知，三组虹鳟鱼肉IMP 的滋味活性值均显著高于AMP 的滋味活性值。

表2 青海省养殖虹鳟鱼肉中核苷酸类物质对比Table 2 Comparison of nucleotides in the meat of farmed rainbow trout in Qinghai province

表3 青海省养殖虹鳟鱼肉呈味核苷酸滋味活性值TAV 对比Table 3 Comparison of taste activity value (TAV) of taste nucleotide in cultured rainbow trout meat in Qinghai province

2.2 挥发性气味物质

青海省养殖虹鳟鱼肉挥发性气味物质对比见表4，公伯峡和拉西瓦产地虹鳟均共检测出69 种挥发性气味物质，其中醇类物质有10 种，酮类8 种，醛类24 种，芳香类4 种，烃类8 种，其他类15 种；龙羊峡养殖虹鳟共检测出61 种挥发性气味物质，其中醇类物质有9 种，酮类7 种，醛类23 种，芳香类4 种，烃类8 种，其他类10 种。龙羊峡虹鳟鱼气味物质中的醇类、酮类、醛类及总挥发性风味物质含量显著低于其他组（＜0.05），公伯峡产地组鱼肉芳香类物质含量显著低于其他组（＜0.05），而拉西瓦产地组鱼肉烷烃类物质显著低于其他产地组（＜0.05）。

表4 青海省养殖虹鳟鱼肉挥发性气味物质含量对比Table 4 Comparison of the content of volatile odorants in the meat of farmed rainbow trout in Qinghai province

续表 4

通过气味活度值法计算筛选出OAV≥1 的气味活性物质，统计见表5，龙羊峡和公伯峡养殖虹鳟共筛出20 种气味活性物质，龙羊峡养殖虹鳟未测出3,5-辛二烯-2-酮，公伯峡养殖虹鳟未测出（E）-2-庚烯醛，拉西瓦共筛出21 种气味活性物质，其中有2 种醇类物质、2 种酮类物质、15 种醛类物质和2 种其他类物质，相比较龙羊峡养殖虹鳟这几种气味活性物质的气味活度值显著性低于其他两个地区的养殖虹鳟鱼（＜0.05），气味活度较高的物质有：2-壬烯醛、辛醛、壬醛、己醛和1-辛烯-3-醇。

表5 青海省养殖虹鳟鱼肉中气味活性物质（OAV≥1）气味活度对比Table 5 Comparison of odor activity of odor active substances (OAV≥1) in farmed rainbow trout meat in Qinghai province

2.3 呈味核苷酸和气味活性物质的主成分分析

如图1，对呈味核苷酸和气味活性物质进行主成分分析（PCA），主成分分析模型中65%的变异可以用PC1（51.9%）和PC2（13.1%）来解释。不同产地养殖虹鳟肌肉的风味差异主要表现在PC1 轴上，从图可以看出拉西瓦和公伯峡养殖虹鳟风味无显著性差异，而龙羊峡养殖虹鳟样品的数据点相距其他两地数据点距离相对较大，可以得到有效区分，表明龙羊峡养殖虹鳟鱼肉风味与其两个产地的养殖虹鳟存在显著差异。

图1 不同产地三倍体虹鳟鱼肉风味物质主成分分析图Fig.1 Principal component analysis diagrams of flavor compounds in triploid rainbow trout from different places

3 讨论与结论

鱼肉的风味是消费者选购时的重要指标之一，目前，呈味核苷酸及其关联物已有30 多种，鱼肉中含量较高的有腺嘌呤核苷酸、肌苷酸及次黄嘌呤等。ATP 及其降解产物是鱼肉中呈味核苷酸的重要组成部分，鱼死后其体内ATP 发生降解，依次生成ADP、AMP 和IMP 等。其中AMP 和IMP 是鱼类重要的呈味核苷酸类物质。AMP 的呈味特点与其含量相关，当含量低于100 mg/100 g 时可以抑制苦味呈甜味，当其含量高于100 mg/100 g 时，甜味减弱，其鲜味增强。本实验测定结果显示青海三个主产地的养殖虹鳟鱼肉中AMP 含量均低于100 mg/100 g，表明AMP 在养殖虹鳟鱼肉中主要呈甜味。通过查阅文献发现AMP 的阈值为50 mg/100 g，本研究中新鲜三倍体虹鳟鱼肉中AMP 含量低于阈值，然而IMP 和谷氨酸及AMP 都存在协同相互作用对鱼肉鲜味有一定的贡献，AMP 对虹鳟鱼肉呈味贡献仍待进一步研究。由于IMP 降解缓慢，其在新鲜鱼肉中的累积能为美拉德反应提供核糖，是重要的风味前体物质和风味增强剂。本研究条件下青海省养殖虹鳟鱼肉中的IMP 含量分别为179～242 mg/100 g，持平或高于吴永俊对不同产地养殖虹鳟鱼中IMP 的含量的报道。本研究中青海省不同产区养殖三倍体虹鳟鱼肉IMP 的差异可能与养殖环境、鱼体规格及取样条件有关。此外，K 值反映了鱼体新鲜度及品质风味的生化指标，是指ATP 最终降解产物（次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤）所占总核苷酸关联物的百分比，一般新鲜剖杀鱼的K 值≤10%，生鱼片的K 值≤20%，二级鲜度20%～40%，初级腐败鱼K 值≤60%～80%，本实验中三个产地虹鳟鱼肉的K 值均小于20%，表明实验所用鱼肉新鲜度较高。

固相微萃取结合气相色谱—质谱联用技术是鉴别和测定挥发性化合物的有效方法，近年来该技术被广泛用于鱼类气味研究中。本研究采用该方法对三个产地的养殖虹鳟鲜肉进行挥发性气味物质的测定，龙羊峡、公伯峡、拉西瓦处理组的挥发性化合物种类分别为61、69 和69 种，主要包括醇类、醛酮类、烷烃类、芳香族以及其他类等几类物质，其中以醛酮类和醇类为主，一般来源于脂质的氧化降解、氨基酸的降解等。为了评价测出的气味物质对三倍体虹鳟鱼肉整体风味的贡献大小，对结果进行OAV计算。OAV 结合了样品中挥发性气味的浓度和气味阈值，能够很好的反应每种化合物对鱼肉整体气味的贡献，经OAV 结果分析可得，青海省养殖虹鳟挥发性气味物质中筛选出21 种气味活性化合物（OAV 大于/等于1），其中对虹鳟整体气味贡献较大的物质有壬醛、辛醛、（E）-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇和己醛等。该研究结果与Ma 等对不同规格的虹鳟鱼气味活性物质对比，筛选的气味活性物质种类及气味活性值相似，均为21 种。

醛类化合物因其具有比醇类和酮类更低的气味阈值，即使浓度低，也可以对食品特征风味形成其重要作用。是肉类食物种重要的挥发性化合物。在本实验中共检测出24 种醛类物质，其中15 种醛类具有气味活性，进一步证实了醛类化合物是许多鱼类的气味活性化合物。醛类化合物主要是在脂质氧化过程中形成。鱼类中的n-9 个单不饱和脂肪酸如油酸，可通过氧化形成壬醛、辛醛、庚醛、癸醛和十一醛等醛类化合物。这几种醛类物质具有青草、油脂和橙子等特征性气味。戊醛、己醛、2-庚烯醛、2-辛烯醛和2-壬烯醛由n-6 个不饱和脂肪酸（如亚油酸或花生四烯酸）生成，这些醛类具有刺激性、油脂味、蘑菇味。4-庚烯醛、2,4-庚二烯醛、2,6-壬二烯醛具有青草味、黄瓜味、鱼腥味，来源于n-3 不饱和脂肪酸（亚麻酸、二十碳五烯酸）。

鱼肉中挥发性醇类主要来源于脂质的氧化降解，对鱼肉气味具有较大影响。在挥发性醇类化合物中，由于不饱和醇的阈值相较于饱和醇低，因此挥发性不饱和醇类可能会对鱼肉的气味贡献有更大影响。在本研究中共鉴定出10 种醇类化合物，其中筛选出2 种气味活性化合物，分别是1-辛烯-3-醇和正庚醇。其中，1-辛烯-3-醇是n-6 不饱和脂肪酸氧化变质的分解代谢产物，具有“泥土味、蘑菇味和发酵味”，广泛存在于鲑科鱼类中。正庚醇是三倍体虹鳟中另一个对气味贡献较大的醇类物质，可产生“青草、发酵、坚果味”，可能来源于油酸的氧化代谢。

酮作为鱼肉中一种重要的挥发性化合物，可能由脂质氧化、氨基酸降解形成，本研究共鉴定出8 种酮类化合物，其中2,3-辛二酮和3,5-辛二烯-2-酮是三倍体虹鳟鱼肉中的气味活性物质，具有“金属和番茄味”。本实验中共检出4 种芳香族类化合物和8 种烃类化合物，然而两组均未发现有气味活性物质，烃类化合物因其气味阈值很高，对鱼肉整体气味贡献很小。杂环类化合物中，2-乙基呋喃和2-戊基呋喃是三倍体虹鳟鱼中两种重要的气味活性化合物，2-乙基呋喃可能源于n-3 不饱和脂肪酸的氧化具有“橡胶、辛辣、绿豆”的气味；而2-戊基呋喃可能来自n-6 不饱和脂肪酸的氧化有着“甘草、橙子”的气味。

三个产地均位于黄河上游，水域位置自上而下依次为龙羊峡、拉西瓦和公伯峡，龙羊峡至公伯峡有184.6 km。龙羊峡水库水温变化较大，水温整体偏高，拉西瓦和公伯峡的水是来自龙羊峡水库的底层水，水流较快，整体水温偏低且温差较小，龙羊峡和公伯峡较拉西瓦水位深。三倍体虹鳟是冷水性鱼类，更适宜于低温水域中生长。三个产地均采用网箱养殖，龙羊峡产地使用100 m 周长的环形网箱，拉西瓦和公伯峡采用8×8 m 的方形网箱，相对较小。这些养殖环境的差异对虹鳟鱼生长产生一定的影响，使得三个产地虹鳟鱼风味存在一定差异。综上，青海省养殖虹鳟鱼肉滋味鲜美，气味活性物质种类较多，拉西瓦和公伯峡养殖虹鳟风味相似，具有较高的肌苷酸含量和挥发性气味物质，整体风味呈鲜味、青草味、油脂味、花香味和鱼腥味。