花旗松素对SGC-7901胃癌细胞生长、运动、氧化应激和p38MAPK信号通路的影响

燕二伟，樊占杰，沈冰冰，张燚

胃癌(gastric cancer，GC)是一种起源于胃黏膜上皮的常见消化系统恶性肿瘤，患病人数呈逐年增加趋势，对人体健康构成严重威胁[1]。在大多数情况下，80%的胃癌是在晚期发现的[2-3]。目前，随着治疗的改善，包括手术、化学疗法和成熟的内窥镜疗法来治疗胃癌，但大多数晚期胃癌的预后仍然很差[4]。大多数患者不可避免地死于肿瘤转移或复发。迄今为止，还没有有效的治疗策略来解决这个问题。因此，探索全新有效的抗胃癌治疗药物是必要的。花旗松素(taxifolin，TXL)，也称二氢槲皮素，是松科植物中常见的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗寄生虫、抗炎、抗菌抗病毒和保护心肌细胞的药理作用[5-9]。花旗松素已被鉴定为多种癌症的潜在的抗肿瘤药，如骨肉瘤，乳腺癌，结肠癌，尤因肉瘤[10-11]。已有相关研究[12]表明，花旗松素具体体外抗肿瘤活性，能抑制人胃癌MGC细胞增殖，可通过调节AhR/CYP1A1信号通路路抑制胃癌的恶性进展[13]。然而，花旗松素对高度侵袭性胃癌的影响和潜在机制仍未确定。因此，本研究探讨花旗松素对胃癌细胞生长、运动以及氧化应激的影响，以期为花旗松素治疗胃癌提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 人胃癌细胞SGC-7901细胞系购自美国典型培养物保藏中心；DMEM培养液、胎牛血清和胰酶购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自美国PIERCE公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)购自南京建成生物工程研究所；MatrigelTM底膜基质、Transwell小室和人工基底膜购自美国BD公司；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、波形蛋白(Vimentin)、神经钙黏蛋白(E-cadherin)、上皮钙黏蛋白(N-cadherin)抗体购自美国Sigma公司；HRP标记的山羊抗鼠二抗购自美国Santa Cruz公司；细胞凋亡检测试剂盒(Annexin PE/7-AAD)购自南京凯基生物有限公司；高速低温离心机购自美国Beckman公司；CO2培养箱购自美国Thermo公司；电泳槽、电转仪购自美国Bio-Rad公司；FACS Vantage SE流式细胞仪购自美国BD公司；凝胶成像系统GDS-800 UVP购自美国UVP公司。

1.1.2 细胞培养 SGC-7901细胞于37 ℃，5% CO2恒温培养箱用DMEM培养基(含10%FBS和1%青-链霉素)培养，当细胞融合度达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，吹打形成单细胞悬液，2～3 d传代1次。实验时选择对数生长期细胞。

1.2 方法

1.2.1 CCK8检测细胞存活率 将SGC-7901细胞接种于96孔板(100 μL/孔)孵育24 h后，用不同浓度(0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200、300 μM)花旗松素处理细胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，用酶标仪测定。并计算花旗松素对SGC-7901细胞的半抑制浓度。

1.2.2 EdU染色检测细胞增殖 取对数生长期的SGC-7901细胞以每孔1×105接种于96孔板，分组处理培养后，于每孔中加入100 μL含50 μmol/L EDU培养基孵育2 h，用PBS洗涤2次，每次5 min。将细胞进行固定和染色后用荧光显微镜进行观测。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 取处理后的各组SGC-7901细胞接种于6孔板，培养48 h后，室温下加入5 μL Annexin V FITC混匀，最后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)10 μL避光孵育15 min，流式细胞仪上机检测。

1.2.4 Transwell检测细胞侵袭 将Matrigel基质胶稀释后加入小室的上室(45 μL/孔)，37 ℃凝固5 h，取经0、25、50、100 μM浓度花旗松素处理24 h后的SGC-7901细胞加入上室，下室加入500 μL含20%胎牛血清的培养液，置于培养箱中培养24 h后取下室，洗涤后用多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下观测并计数侵袭细胞数。

1.2.5 化学比色法检测氧化应激相关指标 试剂盒检测SOD的活性和MDA、GSH的水平，按照SOD、MDA和GSH测定试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 上皮间质转化形态学观察 取各组对数生长期细胞，通过显微镜观察各组细胞上皮间质转化形态学变化。

1.2.7 Western blot检测VEGF、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平 各组SGC-7901细胞加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白含量。10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，200 mA恒流点转移至PVDF膜。加入一抗VEGF(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、p38(1∶1 000)和p-p38(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液清洗后加入辣根过氧化物酶标记的IgG(1∶10 000)，膜上滴加电化学发光显影液显色。ImageJ V软件分析各组TPC-1细胞目的蛋白与β-actin比值。

2 结果

2.1 花旗松素对SGC-7901细胞活力的影响 不同浓度花旗松素处理胃癌SGC-7901细胞24 h后，SGC-7901细胞的存活率以花旗松素浓度依赖的方式降低，当花旗松素浓度超过50 μM时，SGC-7901细胞的存活率较花旗松素浓度为0.5 μM时显著降低(P<0.05)，并计算得出IC50值=54.602，即选择25、50、100 μM浓度进行后续实验。见图1。

2.2 花旗松素对SGC-7901细胞增殖的影响 与对照组相比较，花旗松素50、100 μM组EdU阳性细胞数均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 花旗松素对SGC-7901细胞凋亡的影响 与对照组相比较，花旗松素50、100 μM组细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。见图3。

2.4 花旗松素对SGC-7901细胞侵袭的影响 与对照组相比较，花旗松素50、100 μM组侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)。见图4A、4B。花旗松素50、100 μM组VEGF和Vimentin的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图4C、4D。

2.5 花旗松素对SGC-7901细胞上皮间质转化的影响 与对照组比较，花旗松素50、100 μM组EMT受到抑制，细胞从棒状或长梭形的间充质细胞转化为鹅卵石状或纺锤体形的上皮细胞形态。见图5A。花旗松素50、100 μM组E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图5B、5C。

2.6 花旗松素对SGC-7901细胞氧化应激的影响 与对照组相比较，花旗松素50、100 μM组SOD、GSH-Px活性均显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。见图6。

注：1对照组 2花旗松素25 μM组 3花旗松素50 μM组 4花旗松素100 μM组 与对照组比较，*P<0.05。

2.7 花旗松素对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)活化的影响 与对照组相比较，花旗松素50、100 μM组p38 MAPK磷酸化水平均显著降低(P<0.05)。见图7。

3 讨论

近年来，随着中医药的不断探索，天然膳食提取物作为一种附加的治疗策略，在癌症治疗中表现出独特的吸引力，主要是因为它们容易获得，毒性低，在人体中耐受性好[14]。花旗松素是松科植物中常见的黄酮类化合物，存在于洋葱，水飞蓟，法国海洋树皮和花旗松树皮中[15]。本文研究结果表明，不同浓度花旗松素处理后，SGC-7901细胞存活率以花旗松素浓度依赖的方式降低。因此，选择无显著毒性的花旗松素浓度 (0、5、10、20 μM) 进行后续实验。

癌细胞无限增殖是癌症发生发展的重要机制。研究[16]发现，花旗松素处理可降低ki-67的表达，导致乳腺癌MDA-MB-231细胞存活率和增殖能力下降。同样，用花旗松素处理可以呈剂量依赖性的抑制人皮肤鳞癌细胞增殖[6]。本文研究结果表明，不同浓度花旗松素处理后，SGC-7901细胞EDU阳性细胞数明显减少，提示花旗松素可通过抑制胃癌细胞增殖来影响胃癌的发生发展。

诱导细胞凋亡是治疗胃癌的必要方式之一。研究[6]发现，花旗松素治疗可诱导细胞凋亡抑制瘢痕细胞癌的生长。Razak等[17]对人类结直肠癌HCT116和HT29细胞使用花旗松素会导致细胞生长停滞，在细胞周期的G2期控制细胞周期的分子变化和浓度依赖性的凋亡。本文研究结果表明，不同浓度花旗松素处理后，SGC-7901细胞细胞凋亡率降低，与上述研究结果一致。提示花旗松素可通过诱导胃癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。

恶性肿瘤细胞向周围正常组织浸润和侵袭是导致肿瘤快速增长和蔓延的主要原因，且胃癌细胞的侵袭与上皮间质转化过程密切相关[18]。Vimentin是一种中间丝蛋白，与肺、前列腺和乳腺癌等大多数实体肿瘤类型的转移潜能增加相关[19]。由于Vimentin对于细胞的结构完整性、层状体的形成和粘附信号传导是不可或缺的，下调Vimentin的表达足以改变细胞的体外形态以及抑制细胞的运动和侵袭[20]。VEGF是血管生成的关键调控因子，是大多数癌细胞合成和分泌的，在肿瘤的生长和转移中发挥重要作用[21]。上皮间质转化在胃癌组织和细胞中均表现为上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达的降低和间充质细胞标志蛋白N-cadherin、Vimentin的过表达[22]。研究[16]发现，花旗松素治疗对MDA-MB-231和4T1乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力均有剂量依赖性的抑制作用。花旗松素治疗可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制SSCC癌细胞的增殖和侵袭[6]。本文研究结果表明，不同浓度花旗松素处理后，SGC-7901细胞侵袭细胞数减少，EMT形态学变化受到抑制，E-cadherin蛋白表达水平升高，VEGF、Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平降低，提示花旗松素可抑制胃癌细胞的运动。

GSH-Px和SOD是细胞内抗氧化剂，MDA是脂质过氧化的指标，两者都在细胞氧化应激中发挥重要作用。GSH-Px的消耗由于清除活性氧的损害而导致氧化损伤，SOD可以中和自由基，保护细胞免受氧化损伤[23]。研究[24]证实，花旗松素能提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，具有增强抗氧化酶活性和抑制自由基过氧化的心脏保护作用。本文研究结果表明，不同浓度花旗松素处理后，SGC-7901细胞SOD活性和GSH-Px水平降低，MDA水平升高。提示花旗松素可抑制SGC-7901细胞的氧化应激。

在细胞水平上，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是细胞外和细胞内信号转导的重要桥梁，在MAPK家族中，p38激酶在各种疾病中被发现改变，包括癌症，这些激酶发挥基本作用，有时具有拮抗作用机制[25]。相关研究[26]表明p38 MAPK信号转导通路与肿瘤细胞增殖及凋亡密切相关，p-P38对肿瘤的形成有负向调控作用。p38 MAPK信号通路也可影响 EMT 相关蛋白的表达，包括E-cadherin和波形蛋白，表明p38 MAPK信号通路可调节EMT[27]。本文研究结果表明，不同浓度花旗松素处理后，p38 MAPK磷酸化水平降低。

综上所述，花旗松素可抑制胃癌SGC-7901细胞生长和运动并诱导细胞氧化应激，这可能是通过抑制p38 MAPK的活化实现的。本文为花旗松素应用于临床治疗胃癌提供了实验依据，下一步计划加入p38 MAPK信号通路抑制剂验证花旗松素对胃癌细胞的抗肿瘤作用。