灯盏花素调控Nrf2/Gpx4通路对MIRI模型心肌凋亡的影响及作用机制研究*

石露露，韩卫南，王强，许宁宁

（张家口市第一医院，张家口 075000）

临床治疗心肌梗死方法包括溶栓治疗、冠状动脉介入治疗和支架置入术以恢复心肌血流[1]。然而，急性心肌梗死发作后的心脏再灌注通常导致心肌细胞损伤，这被称为心肌缺血再灌注损伤（MIRI），是急性动脉闭塞和随后的再疏通后的重要并发症[2]。MIRI过程会产生大量的活性氧自由基，导致氧化应激反应引起心肌细胞损伤和凋亡。谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）是一种磷脂氢过氧化物酶起作用，其可以抑制细胞内脂肪过氧化[3]。Gpx4的表达受到Nrf2的靶向调节，近年来有研究发现激活核因子E2相关因子2（Nrf2）/Gpx4信号通路可以缓解MIRI引起的心肌细胞铁死亡[4]，但是其在氧化应激和细胞凋亡中的作用仍不明确。灯盏花素是一种来源于芹菜的黄酮类化合物[5]，最新研究发现灯盏花素对大鼠肝MIRI具有保护作用[6]。本文主要基于Nrf2/Gpx4途径探讨灯盏花素对MIRI动物模型心肌细胞损伤和凋亡的调控机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物与材料 SD大鼠（220～250 g，SPF级，上海克莱斯动物中心，中国）。小动物呼吸机（Inspira ASV，哈佛仪器公司，美国）。灯盏花素片（Z53020121，云南植物药业）。超声心动图（GE公司，美国）。HE试剂（H8070，DH0050，北京 Solarbio公司，中国）。ELISA（S0086，S0131M）和 TUNEL（C1098）试剂盒（Neyotime公司，中国）。RNAspin Mini试剂盒（GE Healthcare，美国）。Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR试剂盒（DBI Bioscience公司，德国）。Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统（Santa公司，美国）。兔单克隆Gpx4一抗（ab125066）、兔多克隆Nrf2一抗（ab92946）和山羊抗兔 HRP-IgG二抗（ab205718，Abcam 公司，美国）。PVDF膜（JS0344，JSENB公司，中国香港）。ECL显色试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）。

1.2 动物分组、建模和干预 45只大鼠随机分为Sham组、MIRI组和MIRI+灯盏花素组，每组15只。MIRI的构建方法简要叙述如下：大鼠麻醉（1%戊巴比妥，40 mg/kg）后连接呼吸机，切开心脏正上方的肌肉打开心包，然后将左前降支冠状动脉结扎，通过观察心电图（ECG）待ST抬高30min后取出结扎线。建模24 h后，MIRI+灯盏花素组使用灯盏花素灌胃，每次剂量按灯盏花素计算为200 mg/kg，每日1次，连续7 d。Sham组和MIRI组使用等量的溶剂灌胃作为对照。

首先腹腔注射1%戊巴比妥（剂量为40 mg/kg）使大鼠麻醉，将针电极皮下插入四肢，并使用心电图通过四肢导线进行监测。在第3和第4肋间隙开胸手术后，将大鼠插管并连接呼吸机（潮气量：3 mL/kg，呼吸频率：60～70 次/min）。在皮肤，浅筋膜和深筋膜上切开，暴露左胸腔并打开心包，然后使用6-0线结扎左前降支冠状动脉，此时ECG改变，心脏表面立即由深红色变为白色，心电图ST段抬高。保持结扎30 min；然后取出丝线进行再灌注。为了防止感染，大鼠在手术后肌肉注射了80万单位的青霉素。Sham组的大鼠进行相同的暴露操作但不结扎。建模24 h后，MIRI+灯盏花素组使用灯盏花素灌胃，根据文献报道[7]，每次剂量按灯盏花素计算为200 mg/kg，每日1次，连续7 d。Sham组和MIRI组使用等量的溶剂灌胃作为对照。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 心功能指标检测 大鼠麻醉后（40 mg/kg的戊巴比妥，腹膜内注射），通过14 MHz相控阵线性仪检测左室收缩末期压力（LVESP）和左室舒张末期压力（LVEDP）大上升和下降速率（±dP/dt max）。

1.3.2 HE染色 梗死边缘组织在室温下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脱水（从低浓度到高浓度）后，将组织包埋在石蜡中。然后将石蜡包埋的小鼠肌肉组织切成5 μm切片，并将这些切片固定在载玻片上。将载玻片在室温下放入苏木精中染色10 min。用自来水洗涤1～2min后，将玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片变蓝。随后用自来水清洗1～2 min后，将玻片放入曙红中10 s。在乙醇（浓度分别为70%、90%、95%和100%，每个浓度处理5 min）中脱水后，将玻片置于二甲苯中2 min，重复此步骤一次。最后，用中性胶密封玻片。在倒置显微镜下观察载玻片。

1.3.3 TUNEL染色 采用4%的聚甲醛固定梗死部位边缘的心肌组织并用梯度乙醇脱水，包埋在石蜡中，制成厚度为5 μm的组织玻片标本，根据试剂盒说明书加入TUNEL染色，洗涤后加入苏木精复染。高倍镜下随机选择5个视野观察凋亡情况计算凋亡指数（=TUNEL阳性细胞数/总细胞核数目×100%）。

1.3.4 ELISA检测 取血液样本通过静置（室温，30 min）和离心（3 000 rpm，半径 8 cm，20 min）分离并收集上层血清，根据说明书加入抗体和显色剂，根据450 nm下检测吸光度和标准曲线计算超氧化歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）浓度。

1.3.5 RT-qPCR检测 使用RNAspin Mini试剂盒从组织中提取RNA，然后使用Bestar qPCR RT试剂盒将其逆转转录为cDNA，条件如下：37℃/15 min；98℃/5 min。然后使用BestarTMqPCR预混液进行qPCR 实验，条件如下：95℃/2 min，94℃/20 s，58℃20s，72℃/20s，40个循环，最后在 72℃下延伸 4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行RT-qPCR分析。GAPDH作为内源参照，通过比较循环阈值评估梗死区域边缘心肌组织中mRNA水平。

1.3.6 蛋白印迹法（Western blot）检测 将心肌组织研磨后萃取总蛋白并检测浓度。然后分别取总量为40 μg的总蛋白进行分离，分离条件为10%的聚丙烯酰胺凝胶、80～120 V、90 min。然后通过湿法进行转膜，在100 mV下将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。将一抗稀释500倍后分别加入膜中并在4℃下孵育过夜。洗涤后加入山羊抗兔HRP-IgG二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h。本次研究内参为GAPDH，分析目标蛋白条带相对于GAPDH的灰度值分析梗死区域边缘心肌组织中蛋白表达水平。

1.4 统计学方法 统计分析使用SPSS 19软件。数据以均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0．05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 灯盏花素对MIRI大鼠心功能的影响 3组大鼠心功能指标比较差异显著（P＜0．05）。MIRI组的LVESP、±dP/dt max显著低于Sham组，而LVEDP显著高于 Sham 组 （P＜0．05），MIRI+灯盏花素组的LVESP、±dP/dt max显著高于 MIRI组，而 LVEDP 显著低于 MIRI组（P＜0．05）。见表1。

表1 灯盏花素对MIRI大鼠心功能的影响Tab.1 Effect of breviscapine on cardiac function of AMI rats

2.2 灯盏花素对MIRI大鼠心肌组织损伤的影响 如图1所示，红色和蓝色分别为细胞质和细胞核。Sham组细胞质染色均匀且细胞核染色清晰，心肌细胞排列有序。MIIR组细胞质染色较轻，细胞质大小不一，心肌细胞正常形态被破坏并出现细胞丢失。MIRI+灯盏花素组的心肌细胞染色基本正常，排列基本有序。

图1 HE染色检测灯盏花素对MIRI大鼠心肌组织损伤的影响Fig.1 HE staining to detect the effect of breviscapine on myocardial tissue damage in MIRI rats

2.3 灯盏花素对MIRI大鼠心肌细胞凋亡的影响 如图2所示，蓝色和棕色分别为所有细胞核和凋亡细胞的细胞核。3组的心肌细胞凋亡情况比较差异显著（P＜0．05）。Sham 组的凋亡指数为（1．86±0．26）%，MIRI组的凋亡指数（24．62±2．89）%显著高于 Sham组（1．86±0．26）%，P＜0．05，MIRI+灯盏花素组的凋亡指数（12．05±1．57）%显著低于 MIRI组（P＜0．05）。

图2 TUNEL染色检测灯盏花素对MIRI大鼠心肌细胞凋亡的影响Fig.2 TUNEL staining to detect the effect of breviscapine on myocardial cell apoptosis in MIRI rats

2.4 灯盏花素对MIRI大鼠氧化应激水平的影响 3组的氧化应激水平比较差异显著（P＜0．05）。MIRI组的 SOD（56．42±6．49）U/mL 显著低于对照组，MDA（13．23±1．46）nmol/mL 显著高于对照组（P＜0．05）。MIRI+灯盏花素组的 SOD（78．05±8．12）U/mL 显著高于 MIRI组，MDA（8．74±0．95）nmol/mL 显著低于MIRI组（P＜0．05），见图3。

图3 灯盏花素对MIRI大鼠氧化应激水平的影响Fig.3 Effects of breviscapine on the level of oxidative stress in MIRI rats

2.5 灯盏花素对MIRI大鼠心肌组织Nrf2/Gpx4通路转录水平的影响 3组大鼠心肌组织Nrf2/Gpx4通路转录水平比较差异显著（P＜0．05）。MIRI组的Nrf2（2．05±0．13）和 Gpx4（1．44±0．11）mRNA 水平显著低于 Sham 组（P＜0．05），MIRI+灯盏花素组的 Nrf2（3．21±0．24）mRNA 和 Gpx4（3．36±0．27）mRNA 水平显著高于 MIRI组（P＜0．05）。见图4。

图4 灯盏花素对MIRI大鼠Nrf2/Gpx4通路转录水平的影响Fig.4 Effects of Breviscapine on the transcription level of Nrf2/Gpx4 pathway in MIRI rats

2.6 灯盏花素对MIRI大鼠心肌组织Nrf2/Gpx4通路中蛋白表达水平的影响 3组大鼠心肌组织Nrf2/Gpx4通路中蛋白表达水平比较差异显著（P＜0．05）。MIRI组的 Nrf2（1．27±0．09）和 Gpx4（0．93±0．08）蛋白水平显著低于 Sham 组（P＜0．05），MIRI+灯盏花素组的 Nrf2（2．06±0．16）和 Gpx4（1．72±0．12）蛋白水平显著高于 MIRI组（P＜0．05）。见图5。

图5 Western blot检测灯盏花素对MIRI大鼠心肌组织Nrf2/Gpx4通路中蛋白表达水平的影响Fig.5 Western blot detection of the effect of breviscapine on the protein expression level of the Nrf2/Gpx4 pathway in the myocardial tissue of MIRI rats

3 讨论

在心肌组织的缺血/再灌注过程中，心肌细胞会大量凋亡，而这会严重影响心功能甚至导致心脏纤维化，影响日常生活和生命安全[8]，但是目前临床上暂时没有缓解心肌MIRI的有效方法。

灯盏花素（其分子式为4，5，6-三羟基黄酮-7-葡萄糖醛酸）是一种来自于传统中草药灯盏花的黄酮类化合物，在临床用于治疗心血管疾病和脑血管损伤[9]。本次研究结果显示灯盏花素可以有效的缓解MIRI引起的心肌组织损伤和细胞凋亡，并提高MIRI后的心脏收缩和射血功能。

为进一步分析灯盏花素缓解MIRI引起的心肌细胞凋亡的机制，笔者检测了心肌组织中氧化应激水平以及Nrf2/Gpx4通路表达水平。已知MIRI引起的继发性过氧化损伤和ROS升高会引起心肌细胞内质网应激损伤和线粒体途径凋亡，而SOD和MDA分别是体内主要的抗氧化和氧化应激指标[10-11]。SOD和MDA的水平受到机体脂质氧化水平的调控，Gpx4是关键的氧化调控蛋白，其可通过抑制细胞膜脂质的过氧化抑制细胞死亡和凋亡[12]。Gpx4的转录水平受到Nrf2的调控，作为转录调节因子，Nrf2被激活后可进入细胞核激活包括Gpx4、SOD在内的抗氧化基因的转录[13]。研究已经证实了激活Nrf2在缓解MIRI损伤和抑制凋亡中的关键作用[14]。本次研究结果显示灯盏花素可以促进MIRI模型心肌组织中Nrf2和Gpx4转录和翻译的水平，提高SOD的水平并抑制MDA。有研究发现灯盏花素可促进Nrf2信号通路并护肝细胞免受缺氧/复氧诱导的氧化损伤[15]。灯盏花素也可通过提高Nrf2 mRNA和蛋白的水平抑制脂质过氧化[16]。此外，一项最新研究结果也发现灯盏花素可通过调节Nrf2信号通路在颅脑损伤后提供神经保护作用[17]。这提示灯盏花素可通过促进Nrf2的表达提高Gpx4的转录和翻译，进而减轻脂质过氧化水平缓解氧化应激反应，进而抑制MIRI引起的心肌细胞损伤和凋亡。

综上所述，灯盏花素具有缓解MIRI模型大鼠心肌细胞凋亡的功能，并且其保护心功能的机制可能与促进Nrf2/Gpx4通路有关。但是关于灯盏花素对MIRI的影响以及调控Nrf2/Gpx4通路的机制仍需要进一步研究。