绿色溶剂提取玉米芯黄酮的纯化及活性测定

于德涵， 黎莉， 杨景淇， 曲男， 徐喆， 孙悦

(绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061)

我国是世界上玉米产量第二大国，每年玉米产量超2.5亿 t，伴随着玉米的加工，每年还有超7 000万t的玉米芯产生。目前，有文献报道的玉米芯应用主要集中在作为饲料、培养食用菌的基料、生产糠醛、糖醇等的原料和发酵生产生物燃料等几个方面[1-3]。据统计，我国每年对玉米芯的利用量不足年产量的20%[4]，80%以上的玉米芯都被焚烧和丢弃，不但提高了环境治理成本，还造成了极大的浪费。

低共熔溶剂(deep eutectic solvents，DES)是一种可生物降解的环境友好型绿色溶剂，在生物活性成分的提取方面多有应用，而且因其具有配制简便、易于保存、安全无毒、成本低廉等优点，渐渐有取代传统提取试剂的趋势[5]。通过前期工作，对提取玉米芯黄酮DES的组成、配比和提取条件进行了筛选和优化，发现使用绿色溶剂提取玉米芯黄酮的提取量较常规有机试剂提高40%以上[5]，表现出了巨大的应用潜力。后续，对大孔树脂吸附纯化玉米芯黄酮的工艺进行优化，并考察纯化黄酮的抗氧化性、抑菌性和降糖能力，以期为玉米芯的综合应用提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米芯(品种为先玉335)，采集于黑龙江省绥化市北林区；实验用菌种由绥化学院微生物实验室保藏；大孔吸附树脂购自东鸿化工有限公司；芦丁标准品、阿卡波糖(纯度>99%)购于上海士锋生物科技有限公司；其余试剂皆为国产分析纯，购自南京都莱生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

752型号分光光度计：上海菁华仪器有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；JY92-IIDN型超声波仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；HL-2型蠕动泵，玻璃层析柱(16 mm×240 mm)：上海青浦沪西仪器厂；RE-52型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ZD-85型恒温振荡器：江苏荣华仪器制造有限公司。

1.3 超声辅助低共熔溶剂提取玉米芯黄酮和含量测定

DES制备：氯化胆碱和乙二醇(体积比1∶3)混合后加30%体积的蒸馏水，在65～80 ℃的水浴中搅拌至溶液澄明，溶液取出静置至室温，即为提取溶剂。

玉米芯黄酮的提取：玉米芯烘干、粉碎、过40目筛，向玉米芯粉末内以20 mL·g-1的液料比加入DES，充分混匀后于60 ℃、135 W功率条件下超声提取20 min。提取液冷却后以5 000 r·min-1离心7 min，吸取上清置于旋转蒸发仪中浓缩蒸发至无液体蒸出，蒸发后余液测定黄酮浓度，保存于棕色瓶中备用。

黄酮含量的测定方法和具体操作参考文献[6]。

1.4 大孔吸附树脂的选择

分别选择极性、孔径等各有差异的吸附树脂共8种参与实验，各大孔树脂型号及参数特性详见表1。

表1 大孔树脂参数

1.5 大孔吸附树脂的活化

将上述8种树脂置于烧杯中，加入无水乙醇浸泡，采用倾倒法除去破损树脂颗粒，待树脂完全溶胀后倾出乙醇，用蒸馏水充分洗涤至树脂无醇味，浸酸4～6 h后用蒸馏水洗至中性，再浸碱4～6 h后用蒸馏水洗至中性[7]，备用。树脂活化所用酸、碱可使用浓度4%～5%的盐酸和氢氧化钠溶液。

1.6 大孔吸附树脂的筛选和装柱

分别将活化后的各树脂2.0 g(湿重)置于容量为100 mL的三角瓶中，每瓶中加入10 mL提取液后用封口膜封口，在恒温振荡器上以30 r·min-1旋转振摇吸附24 h。抽滤，滤液测黄酮含量，计算吸附率。树脂用蒸馏水洗涤至溶液无色，在100 mL三角瓶中加入30 mL 70%乙醇溶液，封口后继续振摇24 h，抽滤，测滤液黄酮含量，计算解吸率[8]。根据各树脂的吸附率和解吸率，筛选适用树脂。

式中：C1、C2和C3分别表示上样液浓度、流出液浓度、洗脱液浓度，mg·mL-1；V1、V2和V3分别表示上样液体积、流出液体积和洗脱体积，mL。

将筛选出的适用树脂湿法装柱，树脂柱高16 cm，蒸馏水液面略高于树脂柱。

1.7 玉米芯黄酮吸附纯化工艺优化

使用1.6筛选出的适用树脂，以吸附率为评价指标，分别改变上样浓度(0.5～1.5 mg·mL-1，梯度为0.25 mg·mL-1)、上样pH(2.0～6.0，梯度为1.0)和上样速率(15～75 mL·h-1，梯度为15 mL·h-1)，考察各单因素变化对黄酮吸附效果的影响；树脂以最优吸附条件吸附饱和后，再分别改变洗脱过程中洗脱液浓度(乙醇浓度40%～90%，梯度10%)、洗脱液流速(60～180 mL·h-1，梯度为30 mL·h-1)和洗脱液量，以解吸率为评价指标考察上述因素变化对吸附纯化解吸效果的影响。其中，上样流出液中黄酮残余量达到上样液黄酮含量的10%时认定为树脂吸附达到饱和。

1.8 纯化条件优化效果验证

选择优化后的吸附和洗脱条件进行玉米芯黄酮纯化操作，对比纯化前、后溶液纯度，通过检测两种溶液浓度的变化计算纯化倍数。

1.9 黄酮体外活性检测

1.9.1 抗氧化能力测定

玉米芯总黄酮粗提液和纯化液对·OH、DPPH和ABTS的清除能力测定参考王广慧等[9-11]的方法进行，使用等浓度的VC做对照。

1.9.2 抑菌活性测定

在50 mL无菌三角瓶中加入15 mL LB培养基，接种大肠埃希氏菌后封口膜密封，于恒温振荡培养箱中37 ℃培养4 h，取出后用分光光度计测各培养液在600 nm波长的吸光值D600，以此为基础在各三角瓶中加入一定比例的无菌蒸馏水，制成浓度相同的菌悬液。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌悬液制备同上。

在几支150 mL容量的三角瓶中各转入50 mL无菌LB培养基，再分别加入5 mL浓度为0.1 mg·mL-1的纯化黄酮和未纯化黄酮，空白对照组加等量的无菌蒸馏水，再将制备好的菌悬液1 mL移入三角瓶中，封口后37 ℃振荡培养12 h，静置2 h后震匀，再测定各管的D600，通过空白对照组和实验组的D600值差值计算细菌减少的百分比，以此反映相同浓度黄酮在相同培养时间内对不同细菌的抑制能力。

1.9.3 降糖活性测定

将1 mL不同浓度的黄酮粗提液与1 mL α-淀粉酶溶液加入25 mL比色管中，37 ℃水浴2 min后加入2 mL浓度为0.1%的淀粉溶液(37 ℃温育)，混匀后在37 ℃的水浴中反应3 min，再向比色管中加入3 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀后移入沸水浴中显色8 min，取出后流水冷却至室温，加蒸馏水至刻度，待管内溶液颜色稳定后用分光光度计测D540；空白对照组用等体积的磷酸缓冲液替代黄酮溶液，吸光值记为D0，阿卡波糖作阳性对照[12]，计算抑制率。替换粗提液为纯化液重复实验。

2 结果与分析

2.1 线性回归方程

绘制标准曲线测定黄酮含量，曲线回归方程为：y=5.427 3x-0.007 2，R2=0.999 4。

2.2 大孔吸附树脂的筛选

树脂筛选的结果见图1。由图可见，在待选的8种大孔树脂中，3种无极性树脂和弱极性的AB-8树脂的吸附率较大且接近，没有显著差异；XAD-2树脂和D101树脂的解吸率最高，二者差异不显著，但显著高于其他几种树脂。作为适于吸附纯化的树脂除了要有较高的吸附率之外，还要能形成可逆吸附，所以综合来看，XAD-2树脂和D101树脂都适合用于玉米芯黄酮的分离纯化，且二者没有显著差异，所以选择这两种树脂进行后续操作。

同系间无相同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)，图2～6同。

2.3 玉米芯黄酮纯化工艺优化

2.3.1 上样液浓度对吸附率的影响

吸附条件选择pH 5.0、流速30 mL·h-1、上样液浓度变化同1.7节进行操作，两种树脂的吸附率如图2所示。XAD-2树脂和D101树脂在上样液浓度变化时吸附率的改变是相似的，都表现为当上样液浓度不高于1.0 mg·mL-1时，吸附率一直维持在一个比较高的水平，随着上样浓度的加大，吸附率变化不大；再继续加大上样液的浓度，吸附率显著下降。当上样浓度低时，两种树脂对上样液中的目的物吸附较为完全，吸附率高，但是达到吸附饱和时耗时更长，效率低下；提高上样浓度后，溶液中杂质含量也增加，导致杂质和黄酮之间吸附竞争增大，阻碍黄酮被吸附，吸附率随之降低，所以1 mg·mL-1是最佳上样液浓度。

图2 上样液浓度对吸附率的影响

2.3.2 上样液pH对吸附率的影响

选择上样浓度和流速分别为1.0 mg·mL-1和30 mL·h-1，上样液pH梯度变化同1.7节所述，吸附率结果见图3。pH 4.0时XAD-2树脂吸附率最高，为75.1%，而D101树脂吸附率略低于此值，但差异不显著；偏离此pH两种树脂的吸附率都会下降。黄酮类化合物结构中多含有酚羟基，在碱性溶液中的溶解性会增大，所以pH高于4.0时，弱酸近中性环境有利于黄酮中酚羟基的解离，溶剂和黄酮之间加强的作用力会抑制吸附；另外，黄酮类化合物结构中还含有酮式羰基，该结构会在低pH环境下成盐，所以pH过低时吸附率下降。故选择4.0为最优pH值。

图3 上样液pH对吸附率的影响

2.3.3 上样流速对吸附率的影响

设置上样液流速梯度变化同1.7节所述、pH 4.0、浓度1.0 mg·mL-1，考察吸附效果最理想的上样流速(图4)。上样流速对两种树脂的吸附率都影响显著。上样流速越慢，吸附液在层析柱中停留时间越长，黄酮有充分的时间扩散到树脂内部，吸附越充分，吸附率高，但操作时间会相对延长；上样流速快，会缩短吸附操作时间、提高效率，但黄酮在层析柱中停留时间缩短会导致吸附率随着流速增加显著下降。通过对效率和效果的综合考量，上样流速为15 mL·h-1最佳。

图4 上样流速对吸附率的影响

2.3.4 洗脱液浓度对解吸率的影响

XAD-2树脂和D101树脂分别以pH 4.0、浓度1 mg·mL-1、流速15 mL·h-1的上样条件进行吸附至饱和，用浓度梯度同1.7节所述的乙醇溶液60 mL，以90 mL·h-1的速率进行洗脱，解吸率结果如图5。两种树脂都是在乙醇浓度为70%时解吸率最高，且没有显著差异；一旦偏离这个浓度，解吸率就会显著下降，而且偏离越远，解吸率越低。造成此现象的原因是玉米芯黄酮的极性和70%乙醇的极性相同，所以在70%乙醇中溶解性最好，容易被该溶液从树脂上洗脱下来，解吸率大；而与70%乙醇浓度差距越大的洗脱液，极性与玉米芯黄酮极性相差越远，溶解性越差，所以洗脱效率更低。故70%乙醇溶液洗脱效果最佳。

图5 洗脱液浓度对解吸率的影响

2.3.5 洗脱液流速对解吸率的影响

分别使用60 mL 70%乙醇采用1.7节所述的梯度流速进行洗脱，对解吸率影响见图6。两种树脂的解吸率都随着洗脱液流速的升高而显著降低，即二者都是在60 mL·h-1的流速下解吸率最高，但二者之间没有显著差异。造成这种结果的原因是洗脱液流速慢时，洗脱液能和吸附物充分接触并将其溶解，有助于吸附物和树脂分离，能够充分洗脱；而洗脱液流速加快后，情况相反，树脂中吸附残留成分多，导致解吸率降低。所以洗脱流速选择60 mL·h-1为佳。

图6 洗脱液流速对解吸率的影响

2.3.6 洗脱液体积对解吸率的影响

树脂吸附饱和后，用100 mL 70%乙醇以60 mL·h-1的速度进行洗脱，洗脱液每10 mL收集一管，分别计算各管的解吸率，结果如图7所示。两种树脂使用同等体积的洗脱液进行洗脱时，XAD-2树脂前期洗脱速度快，后期趋于平缓，第6管洗脱液中黄酮的测量值已经极低，即该树脂使用60 mL洗脱液基本可以完成洗脱；D101树脂的前期洗脱速率相较于XAD-2树脂来说较为平缓，所需的总洗脱液量也稍多。综合来看，两种树脂都选择70 mL洗脱液可以完全洗脱。

图7 洗脱液用量对解吸率的影响

2.4 玉米芯黄酮纯化结果验证

根据上述实验结果，分别选择XAD-2树脂和D101树脂，将pH 4.0、浓度1 mg·L-1的上样液以15 mL·h-1的速度流经二者吸附至饱和，再用流速为60 mL·h-1的70%乙醇70 mL进行洗脱。经计算，通过XAD-2和D101树脂纯化的玉米芯黄酮纯化液纯度为粗提液纯度的2.05倍和1.94倍，说明上述条件下，这两种树脂都可用于纯化玉米芯黄酮，且纯化效果良好。

2.5 体外活性测定

2.5.1 黄酮的抗氧化性检测

分别用XAD-2树脂纯化液、D101树脂纯化液和未经纯化的黄酮粗提液对OH、DPPH和ABTS作用，各清除率见图8。测试浓度范围内的黄酮对3种自由基的清除能力与其浓度正相关，且该能力在黄酮纯化后被增强，故纯化操作能强化玉米芯黄酮成分的抗氧化性；两种不同树脂纯化后的黄酮在对3种自由基的清除能力方面无明显差异，但都明显弱于VC。

图8 玉米芯黄酮的自由基清除能力

2.5.2 黄酮的抗菌能力测定

玉米芯黄酮纯化前、后对实验用3种细菌的抑制能力结果见表2。3种玉米芯黄酮溶液的抑菌率可知，玉米芯黄酮对大肠埃希氏菌的抑制作用最强、对枯草芽孢杆菌最弱；纯化操作对玉米芯黄酮的抗菌性提升有益，但未见对枯草芽孢杆菌的抑制作用有显著增强。

表2 固定浓度黄酮的抑菌效果

2.5.3 黄酮的降糖活性测定

不同浓度的黄酮对α-淀粉酶的抑制能力如图9所示。黄酮的降糖性随着浓度的增加而加强，纯化黄酮的降糖能力明显高于未纯化样品而稍低于对照品阿卡波糖，浓度升高时，纯化黄酮的降糖性更为接近阿卡波糖。

图9 玉米芯黄酮对α-淀粉酶的抑制作用

3 小结

本文主要对DES提取的玉米芯黄酮的纯化工艺进行了优化，并探讨了黄酮的体外活性XAD-2和D101树脂在对玉米芯黄酮的吸附率和洗脱率方面没有明显差异，且在8种待选树脂中效果最佳，皆可作为其纯化的吸附介质；经优化实验筛选出的最优吸附纯化条件为：二树脂将浓度1 mg·mL-1、pH 4.0的待吸附液以15 mL·h-1速度上样，饱和后用70 mL 70%的乙醇以60 mL·h-1的流速洗脱，可分别将玉米芯黄酮纯化2.05和1.94倍；玉米芯黄酮表现出具有清除·OH、DPPH和ABTS能力的抗氧化性，无论纯化与否，抗氧化性皆与黄酮浓度正相关，而纯化会强化该性能；固定浓度的玉米芯黄酮有抑菌作用，其对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抑制作用强于枯草芽孢杆菌，且纯化会加强对前两种细菌的抑制；体外降糖实验表明，玉米芯黄酮对α-淀粉酶的抑制作用随浓度加大而增强，较高浓度的纯化黄酮有接近阿卡波糖的降糖效果。

经以上实验结论可知，DES提取的玉米芯总黄酮可采用XAD-2大孔树脂和D101大孔树脂纯化，两种树脂纯化效果相当，工艺可行。