在线固相萃取-高效液相色谱法测定水中硝基苯与5 种硝基氯苯类化合物

刘寅，段毛毛

(1.吉林省吉林生态环境监测中心，吉林吉林 132001； 2.吉林化纤集团有限责任公司，吉林吉林 132001)

硝基苯类化合物主要用于化工、染料、炸药和制革等工业，是一类污染范围广、危害性大的工业污染物[1]，其中硝基氯苯类在其制造流程中往往由于转化不完全而随废物排放入环境水体中，从而造成地表水和地下水污染[2]，可经皮肤吸收进入人体导致中毒，属高毒类有机污染物[3]。

目前国内监测水中硝基苯类物质的常见方法有气相色谱法[4-6]、气相色谱-质谱法[7-9]、液相色谱法[10-11]和分光光度法[12-13]。分光光度法仪器价格低廉、便携性较高，缺点是准确度差，且不同待测物组分间干扰较大，已逐渐式微[14]；气相色谱法与气相色谱-质谱法测定硝基苯类时，样品在进入仪器分析前需要经过液液萃取或固相萃取(SPE)的富集式预处理步骤，且两种方法样品预处理均需要使用二氯甲烷，二氯甲烷虽本身毒性较低[15]，但在常温下极易挥发，遇热和潮湿可生成含有剧毒的光气。氯化氢和一氧化碳反应生成的混合腐蚀性烟雾，长期接触对人危害较大[16]；高效液相色谱法可免除样品预处理步骤，但未经富集便直接测定会导致各待测物的检出限较高，不利于痕量分析。

在线SPE 法是一种基于阀切换的自动化样品前处理技术，与传统SPE 法相比，具有所需样品量较少、分析快速、操作简便、重现性好、安全性高的优点[17]。笔者采用在线固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)法测定水中硝基苯与5 种硝基氯苯类化合物。该方法的各目标物线性区间宽，精密度、准确度满足分析要求，所需样品量少、操作简便、安全性高，适用于水中污染物的监测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Dionex Ultimate3000 型，配置有VWD3000 型紫外检测器及在线SPE 预处理功能模块，SPE 定量环最大体积为2 500 μL，美国赛默飞世尔科技公司。

超纯水机：Milli-Q Academic 型，美国默克公司。

乙酸纤维微孔滤膜：孔径为0.45 μm。

甲醇中硝基苯、2-硝基氯苯、3-硝基氯苯、4-硝基氯苯标准溶液：质量浓度均为1 000μg/mL，标准物质编号分别为GSB07-1211-2000、GSB07-1215-2000、GSB07-1216-2000、GBW(E)082771，北京环境保护部标准样品研究所。

甲醇中2，4-二硝基氯苯、五氯硝基苯标准溶液：质量浓度均为1 000 μg/mL，标准物质编号分别为BW 900724-1000-A、BW 900748-1000-A，北京坛墨质检科技股份有限公司。

磷酸二氢钾：优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

氢氧化钠：分析纯，北京国药集团化学试剂有限公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Dikma Pure 公司。

实验用水为超纯水，由Milli-Q Academic 型超纯水机制得。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理条件

将水质样品以0.45 μm 滤膜过滤后移入样品瓶上机处理，样品经过在线SPE 柱将包含目标组分的有机类物质与其它无机类物质分离。在线SPE柱选用Acclaim 极性嵌入式固定相RSLC 柱(33 mm×3 mm，3 μm，美国赛默飞世尔科技公司)，柱温为30 ℃，富集液为超纯水和乙腈；为了节省溶剂的同时保护SPE 柱与切换阀，采用梯度富集模式，流量与浓度梯度变化详见表1，富集样品体积为2 500 μL。

表1 在线SPE 富集流量与浓度梯度表

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Acclaim 120 C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技公司)；柱温：30 ℃；进样体积：2 500 μL；流动相：pH 6.5 的磷酸二氢钾缓冲溶液[18]-乙腈，富集-萃取状态切换阀时间为实验开始后第6 min，萃取-清洗状态切换阀时间为第26 min，萃取-分析流路的流动相变化比例采用二段梯度的模式，第一段为5 %/min，第二段为6.25 %/min，具体的流量与浓度梯度见表2；检测器：紫外检测器；检测波长：220 nm；波长宽度：4 nm；以色谱峰面积外标法定量。以质量浓度均为200 μg/L 的标准物质溶液上机测试，目标物的色谱保留时间区间为18.0～24.5 min，标准溶液色谱图如图1 所示。

表2 流动性体积分数梯度表

图1 200 μg/L 标准物质溶液的色谱图

2 结果与讨论

2.1 实验条件选择与优化

2.1.1 进样体积

设置富集体积分别为500、1 500、2 500 μL 的相同浓度标准物质，经过在线SPE 处理后检测，色谱图如图2 所示。

图2 相同浓度待测物不同富集量下的叠加色谱图

由图2 可见，在不超过在线SPE 系统处理能力上限的前提下，萃取体积与检测器上待测物的响应信号呈正相关关系，故直接选择进样器最大体积2 500 μL 进行分析。

2.1.2 在线SPE 柱与色谱柱的组合

(1)在线SPE 柱。分别选择两种尺寸规格的Acclaim 极性嵌入式固定相RSLC 柱作为SPE 柱使用，规格分别为33 mm×3 mm、50 mm×3 mm，其余参数相同。在进样体积为2 500 μL 的情况下，50 mm×3 mm 色谱柱最大工作压力达40 MPa 左右，而33 mm×3 mm 色谱柱为35 MPa 左右，且洗脱所需时间稍短，考虑到标准工作曲线最高点浓度为200 μg/L，进样体积为2 500 μL 时仍未超出后者的富集能力上限，因此最终选择33 mm×3 mm 色谱柱作为在线SPE 柱。

(2)反相色谱柱。分别选用Acclaim 120 C18柱、Venusil ASB C18柱、Acclaim 120 C8柱3 种反相色谱柱对6 种目标物进行测试并考察分离度。当采用C8色谱柱时，2，4-二硝基氯苯与2-硝基氯苯、4-硝基氯苯与3-硝基氯苯分离度很差；两种C18色谱柱的分离效果则较为接近，在待测物浓度较大时，Acclaim C18柱在2-硝基氯苯与4-硝基氯苯的分离上稍有优势，因此最终选择Acclaim C18柱作为分离用色谱柱。

2.1.3 柱温

SPE 柱与分析柱共用一个色谱柱箱，选择柱箱温度分别为20、30、40 ℃，考察液相色谱仪的工作情况。柱温为20 ℃时，由于热胀冷缩的缘故，SPE 柱的工作压力峰值可达41 MPa 左右，影响SPE 柱的使用寿命；而柱温为40 ℃时，SPE 柱与分析柱的压力皆有下降，但目标物色谱保留时间也有提前，且变化程度不一，并导致2-硝基氯苯与4-硝基氯苯的分离度变差，综合考虑，确定柱温选择为30 ℃。

2.1.4 流动相及淋洗梯度

硝基苯在强酸性条件下易被还原为苯胺，硝基氯苯类在pH 较高时水解反应速率则会加快，故流动相pH 应控制在中性范围内。由于2-硝基氯苯、3-硝基氯苯、4-硝基氯苯属于同素异构体，分离难度较大，故流动相起始浓度中水相的比例应较大。以浓度梯度洗脱的方式逐渐缓慢增加有机相的比例直至3 种同素异构体分离完毕，再以高有机相比例洗脱吸附性较强的五氯硝基苯。经测试，在流动相水相中，磷酸盐体系缓冲溶液优于乙酸盐体系缓冲溶液和纯水；有机相中，乙腈体系分离效率高于甲醇，且吸收波长上限较低，对各待测物的分析干扰较小。流动相水相起始比例在90%或以上时，有机相比例增加速率不高于5%/min 时，6 种待测物质即可有较好的分离效果，故流动相变化比例采用二段梯度的模式，第一段为5%/min，用于分离同素异构体，第二段为6.25%/min，可适当增加速率，以便节省时间。

2.1.5 检测器

硝基苯在非衍生化的情况下没有荧光效应，故选择紫外检测器。经测定，各目标物的最大紫外吸收波长：硝基苯为260 nm，2-硝基氯苯、3-硝基氯苯、4-硝基氯苯为220 nm，2，4-二硝基氯苯为250 nm，五氯硝基苯为190 nm。其中五氯硝基苯较为特殊，在吸收波长大于230 nm 之后响应信号会急剧降低，而其它物质的吸收波长宽度均有40～50 nm。若确定吸收波长为190 nm，则有利于五氯硝基苯的测定，但在流动相中乙腈梯度式变化的情况下，溶剂干扰会更加严重，综合多方面的考虑，将检测器波长设定为220 nm，此时相同浓度的各待测物质响应值在同一数量级且均较为明显，而溶剂干扰亦十分微小，可忽略不计。

2.2 标准工作曲线及检出限

移取6 种目标化合物的标准溶液各100 μL，混合后以甲醇定容至2 mL，制成质量浓度为50 μg/mL 的标准储备液，再分别取标准储备液1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、40.0 μL 于10 mL 容量瓶中，以超纯水定容至标线，制备成质量浓度均分别为5.00、10.0、25.0、50.0、100、200 μg/L 系列标准工作溶液，以0.45 μm滤膜过滤后移入样品瓶上机分析。以系列标准工作溶液的质量浓度(x)为横坐标，对应检测器信号的峰面积(y)为纵坐标，进行线性拟合，得到标准工作曲线。

移取6 种目标化合物的标准溶液各1 μL，分别以甲醇定容至1 mL，稀释成质量浓度均为1 000 μg/L 的中间液，取硝基苯、2-硝基氯苯、4-硝基氯苯中间液各4 μL，2，4-二硝基氯苯中间液3.5 μL，3-硝基氯苯中间液5 μL，五氯硝基苯中间液3 μL，混合后以甲醇定容至10 mL，此时硝基苯、2-硝基氯苯、4-硝基氯苯的质量浓度均为0.40 μg/L，2，4-二硝基氯苯的质量浓度为0.35 μg/L，3-硝基氯苯的质量浓度为0.50 μg/L，五氯硝基苯的质量浓度为0.30 μg/L。重复配制上述溶液7 次，以0.45 μm 滤膜过滤后移入样品瓶，上机分析，以环境监测分析方法标准制订技术导则(HJ 168—2020)附录A 中的计算方法得到各目标化合物的检出限[20]。

各目标化合物的线性方程、线性范围、相关系数及检出限见表3。由表3 可知，各目标化合物的质量浓度在5.00～200 μg/L 范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999，检出限为0.06～0.10 μg/L，远远低于地表水环境质量标准中规定的限值[19]，满足常规监测需求。

表3 线性方程、线性范围、相关系数及检出限

2.3 精密度试验

按照1.2 实验方法测定同一被硝基氯苯类物质污染的工业废水样品6 次，试验结果见表4。由表4 可知，6 种目标物测定结果的相对标准偏差为0.5%～2.3%，表明该方法精密度良好。

表4 精密度试验结果

2.4 加标回收试验

分别取20 mL 地表水、工业废水，分别加入4、16 μL 质量浓度为50 μg/mL 的标准储备液，理论加标质量浓度分别为10、40 μg/L，将加标后样品混合均匀后，以0.45 μm 滤膜过滤后移入样品瓶，各加标样品分别检测6 次，测定结果分别见表5、表6。由表5、表6 可知，各目标物的平均加标回收率为98.1%～102%，表明该方法测定准确度较高。

表5 地表水样品加标回收试验结果

表6 工业废水样品加标回收试验结果

3 结语

建立了在线固相萃取-高效液相色谱法测定水中硝基苯与5 种硝基氯苯类化合物的方法，在优化的实验条件下，各待测物检出限远低于地表水环境质量标准中的规定限值，同时也低于传统高效液相色谱法的相应物质检出限，满足各目标物的痕量分析需求。该方法各目标物线性区间宽，精密度、准确度满足分析要求，所需样品量少，操作简便，安全性高，适用于水中污染物的监测。