肿瘤坏死因子-β基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性*

刘利宁，李毓新，王晓芳

西安医学院第二附属医院神经内科，陕西西安 710038

脑梗死是临床常见病，其发病率高、致残率高、病死率高，一直为研究热点。在该病的病理生理过程中，动脉粥样硬化斑块的形成和进展发挥着至关重要的作用[1]。近年来,国外一些研究发现，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)A252G、C804A基因多态性可影响TNF-β的表达水平，进而与动脉粥样硬化性疾病相关[2-3]。本研究应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术和聚合酶链反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)对本地区部分大动脉粥样硬化型(LAA)脑梗死患者及健康对照者的TNF-β A252G、C804A位点基因进行检测分型，旨在探索该基因多态性与LAA脑梗死发病的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院2016年9-12月收治的80例LAA脑梗死住院患者为脑梗死组。患者全部符合《各类脑血管疾病诊断要点》中脑梗死的诊断标准，全部病例均经临床、头部CT及头部MRI扫描证实，且行脑血管评估(颈动脉B超+头磁共振血管造影、头+颈部CT血管造影或脑数字剪影血管造影)证实TOAST分型为LAA，并排除脑梗死出血性转化以及合并多脏器功能不全、风湿免疫性疾病、感染性疾病。其中男42例，女38例；年龄40～75岁，平均(61.2±7.9)岁；体质量指数20.0～26.3 kg/m2，平均(22.9±2.9)kg/m2；病程≤1周，神经功能缺损评分(NIHSS评分)：4～15分。对照组80例，为本院同一时期在门诊体检的健康人群，无脑梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史，经颈动脉B超证实无颈动脉粥样硬化，并排除风湿免疫性疾病以及近2周内发生过炎性病变。其中男40例，女40例；年龄45～72岁，平均(58.0±8.7)岁；体质量指数20.1～26.0 kg/m2，平均(22.5±2.4)kg/m2。两组患者的年龄、性别、体质量指数等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1临床资料 通过问诊和体格检查收集研究对象的临床资料，包括有无高血压、糖尿病病史，有无吸烟、饮酒史，并抽血检测以下生化指标：空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血同型半胱氨酸(Hcy)。

1.2.2DNA提取 取临床采集的外周血样本1.0 mL，以枸橼酸抗凝，用血液基因组DNA分离试剂盒(TIANGEN公司)分离白细胞的基因组DNA，操作按试剂盒说明进行。

1.2.3引物设计与合成 应用Primer 5软件，参照文献[4]设计TNF-β A252G基因引物，P1：5′-AGA GCT GGT GGG GAC ATG TCT G-3′；P2：5′-CCG TGC TTC GTG CTT TGG ACT A-3′。P1、P2扩增第1内含子至第3外显子的一段基因，长度为740 bp。参照文献[5]设计TNF-β C804A基因引物，F1：5′-ACC ACC TGA ACG TCT CTT CCT-3′；R1：5′- GTG AGC AGC AGG TTT GAG GTA-3′，用于检测A位点；F2：5′-GCA TCT TGC CCA CAG CAC-3′；R2：5′-GGC ACT GAA CAA CTG AGT TCC-3′，用于检测C位点。

1.2.4PCR反应体系 (1)A252G位点基因分型检测采用PCR-RFLP方法：扩增体系为25 μL，含100 ng模板DNA，10 pmol引物P1、P2，2×Taq Platinum PCR Master Mix(TIANGEN公司)，去离子水。扩增条件：95 ℃预变性6 min，按以下条件循环30次，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。末次循环后，72 ℃再延伸7 min。取10 μL PCR扩增产物，加入10 U NcoⅠ(Takara公司)，于37 ℃孵育2 h。(2)C804A位点基因分型检测采用PCR-SSP方法：扩增体系为25 μL，含100 ng模板DNA，10 pmol引物F1、R1，F2、R2，2×Taq Platinum PCR MasterMix(TIANGEN公司)，去离子水。扩增条件：95 ℃预变性10 min，按以下条件循环30次，95 ℃变性1 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。末次循环后，72 ℃再延伸5 min。

1.2.5PCR-RFLP产物分析 酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果经凝胶成像系统拍照，分析判读。

1.2.6PCR-SSP产物分析 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果经凝胶成像系统拍照，分析判读。

2 结 果

2.1两组临床资料比较 脑梗死组中合并高血压、糖尿病、吸烟史患者所占比例显著高于对照组(χ2=30.83、10.46、8.03，P<0.05)；脑梗死组中FBG水平显著高于对照组(t=-3.21,P<0.05)；两组中有饮酒史者所占比例、TC、TG、LDL-C、Hcy水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2基因型的确定

2.2.1TNF-β A252G基因型确定 GG型，扩增的基因片段含有NcoⅠ酶切位点，可被完全酶切为555、185 bp；GA型，产生不完全酶切，出现740、555、185 bp共3条带；AA型，不产生酶切，电泳后只出现740 bp条带。见图1。

注：M为DNA分子量标准。
图1 TNF-β A252G基因酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.2.2TNF-β C804A基因型确定 CC型为218 bp，CA型为218、279 bp，AA型为279 bp。见图2。

注：M为DNA分子量标准。
图2 TNF-β C804A基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.3基因型频率、等位基因频率分析 脑梗死组TNF-β A252G中GG的基因型频率高于对照组(P<0.05)；AA基因型频率低于对照组(P<0.05)；G的等位基因频率在脑梗死组中高于对照组(P<0.05)；A的等位基因频率低于对照组(P<0.05)。见表2。TNF-β C804A中AA基因型频率在脑梗死组中高于对照组(P<0.05)；A的等位基因频率高于对照组(P<0.05)；CC基因型频率、C的等位基因频率低于对照组(P<0.05)。见表3。

表2 TNF-β A252G基因多态性比较[n(%)]

表3 TNF-β C804A基因多态性比较[n(%)]

2.4影响LAA脑梗死发生的多因素分析 将脑梗死作为因变量，高血压、糖尿病、吸烟史、FBG水平、TNF-β A252G基因型分布、TNF-β C804A基因型分布为自变量，进行Logistic回归分析。结果显示，高血压、糖尿病、吸烟史、FBG水平、TNF-β A252G基因型为GG型、TNF-β A252G等位基因为G型、TNF-β C804A基因型为AA型、TNF-β C804A等位基因为A型是LAA脑梗死发生的危险因素。见表4。

表4 影响LAA脑梗死发生的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

TNF-β是淋巴细胞在抗原或有丝分裂原刺激下分泌的一种重要的促炎细胞因子。SCHREYER等[6]应用免疫组化染色技术发现TNF-β在动脉粥样硬化斑块内广泛表达；与此同时，他们还发现与野生鼠相比，TNF-β基因敲除小鼠形成的动脉粥样硬化损伤体积减少为原来的62%[6]。QIAN等[7]研究显示，给予ApoE基因敲除小鼠短时间注射重组人TNF-β拮抗剂可以抑制动脉粥样硬化病变。这些研究均提示TNF-β作为一种致炎因子，在动脉粥样硬化斑块的发生、发展中，起着重要的作用。其主要途径为通过激活NF-κB信号通路促进血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、E选择素(E-selectin)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等高表达，使得白细胞黏附到血管内皮细胞，并向血管内膜下间隙迁移，释放大量活性氧和弹性蛋白酶，继而损伤血管壁[7-8]。

TNF-β基因位于染色体6p21(MHCⅢ类基因区)内，由4个外显子和3个内含子组成。A252G基因位于TNF-β基因第1内含子+252位点，当碱基为G时,产生了NcoⅠ的识别位点,能被NcoⅠ限制性内切酶识别切断，该基因称为TNF-β*1，当碱基为A时，改变了NcoⅠ位点，该基因称为TNF-β*2。C804A基因位于TNF-β基因第3外显子+804位点，该位点存在1个C到A突变的单核苷酸多态性，可导致密码子26编码的氨基酸由苏氨酸变为天冬氨酸。MESSER等[9]认为A252G能导致TNF-β表达水平升高，TANAKA等[10]亦发现252A/G突变后可使TNF-β的转录活性提高1.5倍，且他还证实了804C/A突变后血管平滑肌细胞产生VCAM-1、E-selectin的能力可提高2倍。故本研究选取LAA脑梗死患者为主要研究对象，进行TNF-β A252G、C804A基因多态性分析，探讨它们之间的相关性。

已有国内外学者对TNF-β A252G、C804A基因多态性与脑梗死的相关性进行研究，但结论尚不统一。ZHAO等[11]在汉族中选取了1 124例脑梗死患者和1 163例健康对照者检测分析TNF-β A252G基因多态性分布，结果发现A252G基因频率增高是无高血压缺血性脑卒中的风险因子。UM等[12]在对294例脑梗死患者和581例健康对照者进行的TNF-β A252G基因多态性分析中却发现脑梗死患者AA基因型频率较健康者增高(χ2=6.991，P=0.03)，可能的机制为该基因型导致了TNF-α、白细胞介素(IL)-6等经典炎症因子的高表达[13]。与上述结果不同，FASIHI等[14]在伊朗东北部地区进行了类似研究，选取了186例LAA脑梗死患者，结果未能发现TNF-β A252G与脑梗死的相关性。除此之外，为探究TNF-β C804A与脑梗死是否具有相关性，TROMPET等[15]对5 389例合并多种心脑血管疾病危险因素的人群进行跟踪随访研究，结果显示，携带TNF-β C804A基因可能增加男性脑梗死的发生率，且基因型AA与基因型CA相比发生脑梗死风险更高(HR：2.07vs.1.43)。近年来还有部分研究对脑梗死患者同时进行TNF-β A252G、C804A基因多态性的分析。KUMAR等[5]在印度北部地区收集了250例脑梗死患者的外周血液标本，分析TNF-β A252G、C804A的基因多态性，最终得出结论：TNF-β A252G、C804A基因多态性与总卒中风险无相关性，但A252G基因多态性与小动脉闭塞型脑梗死具有相关性。而SZOLNOKI等[16]研究则显示TNF-β A252G与C804A为共存关系，同时承载A252G、C804A的单体型为大动脉粥样硬化型CI的遗传易感因素，但与小动脉闭塞型脑梗死无明显相关性。尽管如此，HAGIWARA等[17]抽取日本地区1 044例脑梗死患者和1 044例健康对照者进行TNF-β A252G、C804A基因多态性分析，却发现两者缺乏相关性。

本研究结果显示，脑梗死组TNF-β A252G、C804A基因型分布与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，其中TNF-β A252G的GG、TNF-β C804A的AA基因型频率明显高于对照组(P<0.05)。除此之外，本研究还比较了TNF-β A252G、C804A等位基因频率，发现脑梗死组TNF-β A252G的G、TNF-β A804A的A等位基因频率亦显著高于对照组(P<0.05)。由于在临床资料比较中，脑梗死组合并高血压、糖尿病、吸烟史的患者所占比例及FBG水平明显高于对照组(P<0.05)，而这些因素为脑血管病传统危险因素，需进一步采用Logistic回归分析，规避上述因素对研究结果的干扰，结果仍提示TNF-β A252G基因型为GG型、等位基因为G型、TNF-β C804A基因型为AA型、等位基因为A型是LAA脑梗死发生的独立危险因素(OR=2.29、1.79、2.23、1.74)。上述结果说明TNF-β A252G的GG、TNF-β C804A的AA基因型可能是LAA脑梗死的易感基因，携带此基因型会增加LAA脑梗死的易感性，可能的机制为这些基因型或等位基因导致了TNF-β的高表达，进而促进动脉粥样硬化的形成和发展。除此之外，这两个基因座位具有连锁不平衡性(LD)，当第一个内含子252位为G时，常常伴随着第3外显子区域内804位点处突变为A，导致密码子26编码的氨基酸由苏氨酸变为天冬氨酸，而当一个内含子252位为A时，第3外显子区域内804位点处常替换为C，导致密码子26编码的氨基酸为苏氨酸[9,16]。

综上所述，TNF-β A252G、C804A基因多态性与LAA脑梗死发生有关，TNF-β A252G基因型为GG型、等位基因为G型，TNF-β C804A基因型为AA型、等位基因为A型可能是LAA脑梗死的易感基因，有望成为脑梗死高危人群筛选的标志物及干预靶点，但仍需扩大样本量、检测基因表达产物进行更为精细化验证。