血清ACA、β2GP1抗体与生殖道病原体感染在不孕及复发性流产的检测价值

阿尼克孜·阿不都艾尼 木则帕尔·太来提 曾涛 许爱敏

近年来，育龄人群不孕症及复发性流产的发病率有逐年上升的趋势［1］。大量的研究表明，不孕症及复发性流产原因非常复杂，包括生殖道的感染、畸形、内分泌紊乱、染色体异常及自身免疫因素等。不孕症及复发性流产严重影响患者生活质量及家庭和谐、社会稳定，因此已成为一个值得关注的公共健康问题。

抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）是由于免疫系统无法识别细胞膜脂质双层磷脂，导致其暴露于内层之外而产生，与磷脂结合会争夺胎盘血管，形成血栓，影响生育［2］。抗β2-糖蛋白1（β2-glycoprotein-1 antibody，β2-GPI）抗体是病理状态下心磷脂靶抗原与血清中β2-GPI 结合暴露抗原位点，诱导产生自身抗体，与女性不孕不育及先兆流产密切相关［3］。人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）、沙眼衣原体（Chlamydia trachamatis，CT）及解脲支原体（Ureaplasma urelyticum，UU）结构稳定，传染性强。据报道，宫颈HPV 感染者自然流产率可能高于非感染者［4］。CT以及UU 与女性不孕、异位妊娠、男性不育、宫内死胎、新生儿死亡以及婴儿早产关系密切［5-6］。单个指标检测不能完全找到病因，因此，多个指标检测才具有更大的临床意义。

因此，本研究旨在探讨血清ACA 和β2-GPI 抗体以及生殖道HPV、CT、UU 感染与不孕及复发性自然流产的关系及五个指标联合检测的应用价值，为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2020年1月至2021年11月在喀什地区第一人民医院诊断为不孕症及复发性流产的患者100 例为研究对象。纳入标准：①参与研究前未服用过任何抗菌药；②丈夫精液检查结果正常，未见染色体异常；③孕妇对本次研究知情，且自愿签署知情同意书。排除标准：①排除生殖道畸形；②遗传性疾病、内分泌失调；③血型不合及染色体异常。选择有孕产史的准备备孕的正常妇女100名为对照组。研究经医院伦理委员会同意批准。

1.2 检测方法

1.2.1 标本采集

血样采集：所有检查者采集空腹静脉3 mL，1 h内离心（转速3 500 r/min，离心半径8 cm，离心时间10 min）分离血清，如果不能及时检测，于-20℃冰箱冻存。宫颈分泌物采集：暴露宫颈，无菌干棉拭子伸入宫颈至内口水平停留30 s，再旋转数周后取下放入无菌干燥试管中（有出血的，待恶露干净后采集标本），将棉拭子取出放在1.5～2.0 mL 生理盐水中浸泡备用。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 ACA 检测 ELISA（酶联免疫吸附法）进行检测，用抗心磷脂抗体IgA/IgG/IgM 检测试剂盒（欧蒙医学实验诊断股份公司，德国），将样本血清进行稀释（1∶200）后，取出所需反应板将样本加入微孔中，室温25℃下孵育30 min，每孔加入酶标记溶液100 μL，室温20℃下孵育60 min 后，用洗板机洗板3 次，每次之间静置15 s，分别加入显色剂A 和B 液（各50 μL）混匀，室温20℃下避光孵育15 min 后，加入50 μL 的终止液。30 min 内使用酶标仪（郑州安图生物工程股份有限公司）在波长450 nm 下读取各孔的OD 值，并计算Cut off 值，Cut off 值≥12 RU/mL，为ACA 阳性，反 之则为ACA 阴性。

1.2.2.2 β2-GPI 检测 ELISA（酶联免疫吸附法）进行检测，用抗β2 糖蛋白1 抗体（IgA/IgG/IgM）检测试剂盒（欧蒙医学实验诊断股份公司，德国），每孔加入100 μL 血清，，37℃孵育60 min ，用洗板机洗板5 次，每孔加入酶标抗体100 μ L，37℃孵育60 min，用洗板机洗洗板5 次，加底显色剂100 μL，室温下避光孵育15 min，加50 μL 的终止液，30 min 内使用酶标仪（安图实验室仪器，郑州有限公司）在波长450 nm 下读取各孔的OD 值，并计算Cut off 值，Cut off 值≥20 RU/mL，为β2-GPI 阳性，反之则为β2-GPI 阴性。

1.2.2.3 HPV 检测 PCR 反向点杂交方法进行检测，使用人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测试剂盒（亚能生物技术深圳有限公司）。操作过程严格按照说明书进行。样本DNA 提取：轻微振荡悬浮保存液中的脱落细胞，取保存液于1.5 mL 离心管中离心（转速13 000 r/min，离心半径5 cm，离心时间10 min），去上清液。加入100 μL 裂解液，振荡混匀，将离心管放入100℃水浴10 min。核酸释放后，离心10 min（转速13 000 r/min，离心半径5 cm），保留上清液以备检测。用全自动医用PCR 分析系统（SLAN96P，上海宏石医疗科技有限公司）进行PCR扩增：按照试剂盒说明书要求配制相应数量的PCR反应试剂，然后加入提取的DNA 模板，进行PCR扩增。扩增条件按照试剂盒说明书进行设置。结果判断：根据试剂说明书，膜条上蓝色斑点显现的位置读取相应位置上标注的基因型信息。

1.2.2.4 UU、CT 检测 PCR 荧光探针法进行检测，使用沙眼衣原体核酸检测试剂盒（批号：2021010，20 人份/盒，广州达安基因股份有限公司）及解脲支原体核酸检测试剂盒（批号：202101008，20 人份/盒，广州达安基因股份有限公司），操作过程严格按照说明书进行。将封闭在无菌生理盐水试管中的标本充分悬浮后离心10 min（转速13 000 r/min，离心半径5 cm），弃去上清后，加DNA 提取液50 μL，涡旋混匀，煮沸10 min，于4℃冰箱中裂解6～8 h，核酸释放后，离心10 min（转速13 000 r/min，离心半径5 cm），保留上清液以备检测。取上述裂解液上清2 μL 置于PCR 反应管中，于转速为6 000 r/min 下离心10 min，扩增条件按照试剂盒说明书进行设置，反应结束后使用实时荧光定量PCR 仪（AGS4800，杭州安杰思生物科技有限公司）进行检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0.0 进行数据分析；计量资料以（±s）表示；计数资料以n（%）表示，应用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组ACA 和β2-GPI 检测情况的比较

两组ACA 指标的阳性检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组β2-GPI 指标的阳性检出率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组阳性率比较［n（%）］Table 1 Comparison of positive rates between the two groups［n（%）］

2.2 两组HPV、CT 及UU 检测情况的比较

两组对应的HPV、CT 及UU 的阳性检出率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。从受检人员HPV 感染类型及构成来看，200 名受检人员中检出HPV 感染者23 名，检出率达11.5% ，感染类型主要为单一基因型别，构成比8%，同时存在双重和多重基因型别。见表3。

表2 两组阳性率比较［n（%）］Table 2 Comparison of positive rates between the two groups［n（%）］

表3 受检人员HPV 感染类型及构成［n（%）］Table 3 Types and composition of HPV infection in the tested personnel［n（%）］

3 讨论

不孕不育以及复发性流产一直是困扰着人类生殖健康的难题。目前，研究已经发现ACA 和β 2-GPI 抗体以及生殖道病原体感染对不孕不育和复发性流产女性患者的病因分析和临床诊断具有重要的指导意义。

ACA 近年来临床上研究的热点免疫因素。研究发现，血清ACA 阳性育龄期妇女妊娠容易合并胎盘血管内皮损伤、血栓形成以及胎盘梗阻的病理改变，损害胎盘功能，进而胎盘和胎儿缺血缺氧，引起流产，这本身是一种自身免疫疾病，称为自身免疫性流产。目前该抗体已作为抗磷脂综合征的指标之一，被广泛用于临床检测与研究，它是抗磷脂综合症的标志性抗体，是现今已知可直接诱发血液高凝状态的唯一自身抗体［7］。这方面的研究正在不断发展，因为这些抗体的临床相关性还未完全阐明。研究最多的抗体是抗磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、波形蛋白/心磷脂复合物和膜联蛋白A5 的抗体［8］。国内的大量研究显示，ACA 阳性率明显高于对照组。陈玉阁的研究中［9］，研究组的ACA 阳性率（37.97%）明显高于对照组的阳性率（3.84%）。乔彦杰的研究结果显示［10］，ACA 检测为阳性率（31%）明显高于对照组阳性率（12.2%）。本研究结果显示，研究组ACA 阳性率（3%）与对照组（0%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），这可能是一方面缺乏标准化试剂盒，导致不同实验室之间抗体阳性率的显著差异［11］。另一方面由于人群地区差异，疾病的发生率与沿海地区有一定的差别。因此，ACA 可能不是本地区不孕和复发性流产的原因之一，但是需要扩大样本量，进一步地研究。

β2 糖蛋白-1（β2-GPI）是载脂蛋白，由肝细胞合成、胎盘产生，会抑制内源性凝集通路，抑制血小板凝血酶原活性，表明β2-GPI 是血栓形成致病因素［12］。且其为重要结合辅因子，能与单核细胞、内皮细胞、血小板、蜕膜细胞、滋养层细胞表面受体与凝血因子结合，引发细胞凋亡、炎症反应、凝血功能障碍、内皮细胞损伤；其水平增高常见于习惯性流产、免疫性不孕不育，是女性不孕不育及先兆流产的重要因素，与ACA 联合诊断可提高女性不孕诊断准确率，有助于临床治疗［13］。陈玉阁的研究显示［9］，研究组的阳性β2-GPI 率（39.24%）明显高于对照组的阳性率（2.56%）。乔彦杰的研究结果显示［10］，β2-GPI 阳性率（17%）明显高于对照组的阳性率（7.8%）。本研究结果显示，研究组β2-GPI 阳性率为31%，对照组为2%，与对照组比较，差异有统计学意义，因此，不孕症或有过复发性流产史或死胎的孕妇应该提前检查β2-GPI，在下一次妊娠之前判断是否需要合理预防用药，来避免流产的发生。

HPV 感染与宿主的免疫状态明确相关，目前关于HPV 感染导致早期胚胎发育不良的体内研究证据很少，但体外研究证明HPV 感染增加了囊胚细胞的凋亡和减少了滋养层细胞在子宫内膜的植入［14］。一项病例对照研究发现，宫颈HPV 感染阳性率在RSA 患者中明显升高（35.0%），高于对照组（12.5%），且以HPV 16 感染为主（85.71%），差异有统计学意义［15］。钟小敏［16］的一项研究显示，RSA组（34.7%）宫颈HPV 感染率高于对照组（12.6%），但感染类型比较，差异无统计学意义。本研究结果显示，研究组HPV 阳性率（17%）与对照组HPV 阳性率（6%）比较，差异有统计学意义。不孕及复发性流产患者中，单一基因型别感染率构成比（16/17）69.60%，双重基因型别感染构成比为（5/23）21.74%，多种基因型别感染构成比为（2/17）4.35%，说明是特异型别的HPV 基因型和致病力的强弱决定了不孕及复发性流产的发生。

UU 感染极易诱发复发性流产或不孕。安泓霏等指出，子宫内膜炎患者UU 感染阳性率为32.88%，造成胎儿早产或胎膜破裂比例达62.50%，强调要在围生期加强UU 感染筛查以便及时治疗。在不孕及复发性流产中CT 感染也是是原因之一，也是较常见的性病之一。邢娴静等［17-18］指出解脲衣原体、沙眼衣原体与复发性自然流产密切相关，复发性流产患者蜕膜组织中UU 阳性率77.78%（63/81），CT 阳性率60.49%（49/81），UU+CT 阳性率43.21%（35/81）。本研究结果显示，CT 及UU 的阳性率分别为21%、14%，说明本地区该项目仍然是不孕症和复发性流产的重要检测指标。

喀什地区多个民族聚集在一起，公共卫生优先级较低，当地人民相关专业知识缺乏，在这样低收入地区进行认知教育和预防疾病知识宣传是很必要的。抗心磷脂抗体、抗β2 糖蛋白1 抗体以及人乳头瘤病毒（HPV）、沙眼衣原体（Ct）、解脲支原体（UU）感染与复发性流产及不孕关系密切，临床中应做好孕前和孕妇早期筛查，及时发现及时治疗，减轻病人及家庭的经济负担，社会效益及经济效益均佳。