基于非靶向代谢组学方法探究德昂酸茶与普洱茶（熟茶）之间的成分差异

毛鸿霖，杨 莉，肖 蓉，杨卫星，侯 艳

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.普洱学院生物与化学学院，云南 普洱 665000；3.云南农业大学茶学院，云南 昆明 650201）

酸茶，当地人又称之为“湿茶”或“沽茶”，是云南少数民族茶文化的重要组成部分，也是我国非物质文化遗产之一。酸茶属于全发酵茶类，通过微生物发酵形成其独特的品质，味微酸而清香，口感回甜；富含茶多酚、游离氨基酸、咖啡碱等活性物质，具有提神醒脑、生津止渴、解暑消热、开胃消食、调节肠道微生物等功能。本课题组的前期研究也发现，德昂酸茶还具有调节肠道微生物、抗肥胖以及防治非酒精性脂肪肝的作用。因此，当地人除将其作为饮料外，还会把它融入到各大菜肴中，形成极具民族特色的食物。

普洱熟茶，属于后发酵茶，主要产于中国云南省的西双版纳、临沧、普洱等地区。普洱熟茶具有干茶色泽褐红、条索肥厚、汤色红亮、陈香明显、滋味醇厚回甘、耐冲泡耐贮存的特点，同时通过前人研究可发现，其具有降血脂、抗突变、抗氧化、抗肿瘤、抗肥胖和抑制毒性等作用，受到众多茶叶爱好者的青睐，早已成为当地地理标志性产品。而从原料上看，德昂酸茶可以说与普洱熟茶同宗同源，都以云南大叶种茶树为原料，却在经过不同的发酵方式过后，形成外观、口感和色泽差异明显的两类茶叶。而目前进行的研究大多都是测定不同茶类样本中某种特定的物质含量，对茶样整体代谢物进行比较分析的研究尚少，徐春晖等利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪建立一种狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶品质鉴别的非靶向代谢组学分析方法。通过对222 个特征差异物进行鉴定，最终鉴定出22 个，主要成分为黄酮类、糖苷衍生物和有机酸类等，为茶叶品质鉴别提供理论依据。解东超等运用液相色谱-质谱进行紫娟烘青绿茶加工过程中花青素变化规律研究，为紫娟绿茶加工工艺的优化提供一定的理论基础。但鲜见有针对德昂酸茶以及普洱熟茶这2 类云南省特色茶叶之间代谢差异物质的进行非靶向代谢组学研究。

非靶向代谢组学是对生物系统中小分子代谢物进行可靠、系统的定性和定量分析，通过数据整合不仅可以可视化分析样本差异，还能准确地找出差异代谢物。而常见的代谢组学检测技术主要为液相色谱-质谱联用、核磁共振光谱和气相色谱-质谱。现目前代谢组学技术已被广泛应用于茶产业的多个环节中，可以用来了解茶叶从种植、加工、饮用过程中内含物质的变化规律，从而揭示茶叶特殊风味的形成原理。林洁鑫等采用感官审评方法及超高效液相色谱-串联质谱的广泛靶向代谢组测定方法，对福建省福安市和尤溪县产的红茶中的代谢产物进行比较分析。结果表明福安红茶以“醇和”的滋味特征为主，尤溪红茶以“甘醇”的滋味特征为主，两地红茶的氨基酸和黄酮类物质代谢水平具有显著差异，可能是形成两地红茶滋味品质差异的原因。与其他代谢组学技术相比，超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱具有较好的灵敏度和选择性，并且单位时间可以扫描多个化合物，通过精确质量数和同位素峰形进行数据库检索比对，快速地对目标化合物和未知化合物实现筛查与鉴定。

因此，本研究通过对同种原料不同加工工艺制成的德昂酸茶和普洱熟茶进行非挥发物和代谢物检测，采用超高效压液相色谱与-四极杆飞行时间质谱结合非靶向代谢组学技术对德昂酸茶与普洱熟茶的非挥发代谢物进行全面检测分析，通过获取代谢物的丰度信息，探究2 类茶叶的主要差异并寻找潜在代谢差异物，以期为2 种茶叶品质形成提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

德昂族酸茶（2017年03月）产于云南德凤茶业有限公司；普洱熟茶（2010年10月）产于云南省普洱茶树良种场。

福林-酚试剂、甲醇、没食子酸（相对分子质量188.14）、葡聚糖（葡萄糖）、蒽酮、乙醇、浓硫酸、浓盐酸、咖啡碱（纯度不低于99%）、磷酸缓冲液（pH 8.0）、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、茶氨酸（纯度不低于99%）、甲醇、乙腈、醋酸铵、氨水 美国CNW Technologies科技公司；-2-氯苯丙氨酸 上海恒柏生物科技有限公司；所有化学试剂均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

DGF30-A电热鼓风干燥箱 南京试验仪器厂；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；1290UHPLC超高效液相色谱仪 美国Agilent科技公司；Triple TOF 5600高分辨质谱仪 美国AB SCIEX有限公司；Heraeus Fresco17离心机 美国Thermo Fisher Scientific科技公司；BSA124S-CW天平美国Sartorius科技公司；JXFSTPRP-24研磨仪 上海净信科技有限公司；明澈D24 UV纯水仪 德国Merck Millipore科技公司；PS-60AL超声仪 深圳市雷德邦电子有限公司；ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 非挥发物检测

水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中第一法（103±2）℃恒重法测定；水浸出物含量：参照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》测定；茶多酚含量：参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，采用福林-酚法测定；咖啡碱含量：参照GB/T 8312—2013《茶 咖啡碱测定》，采用紫外分光光度法测定；游离氨基酸总量：参照GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量测定》，采用茚三酮比色法测定；茶多糖含量：采用蒽酮-硫酸法测定。

1.3.2 代谢物检测

1.3.2.1 代谢物提取

称取德昂族酸茶和普洱熟茶样本各50 mg，加入1 000 μL含有内标（1 000∶5，/）的提取液（甲醇-乙腈-水，2∶2∶1，/，内标1 mg/mL），涡旋混匀30 s；加入瓷珠，45 Hz研磨仪处理4 min，超声5 min（冰水浴）；重复步骤2～3 遍；-20 ℃静置1 h；将样本4 ℃、12 000 r/min离心15 min；小心地取出500 μL上清液于EP管中；在真空浓缩器中干燥提取物；向干燥后的代谢物加入300 μL提取液（乙腈-水，1∶1，/）复溶；涡旋30 s，冰水浴超声10 min；将样本4 ℃、12 000 r/min离心15 min；小心地取出60 μL上清于2 mL进样瓶上机检测。各茶叶样本均有3 个生物学重复。

1.3.2.2 液相色谱分析条件

UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；进样体积2 μL；流动相洗脱程序见表1。

表1 液相色谱流动相条件Table 1 Mobile phase conditions of HPLC

1.3.2.3 质谱分析条件

AB 5600 Triple TOF质谱仪能够在控制软件（Analyst TF 1.7, AB SCIEX）控制下基于数据依赖采集功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。电子轰击能量30 eV，15 张二级谱图每50 ms。电喷雾离子源参数设置如下：雾化气压60 psi，辅助气压60 psi，气帘气压35 psi，温度650 ℃，喷雾电压5 000 V（正离子模式）或-4 000 V（负离子模式）。

1.4 数据处理

结果以 ±表示；使用SPSS 21.0软件进行数据统计分析；使用普洱熟茶oteoWizard软件将二级质谱原始数据转成mzXML各式。再使用XCMS做保留时间矫正峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，同时使用自撰写R程序包和自建二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。采用R软件对鉴定的代谢产物进行主成分分析（pcincipal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。根据OPLS-DA模型获得的变量重要性投影（variable importance in project，VIP）评分，将VIP值大于1且值小于0.05的代谢物定义为差异代谢物（significant changed metabolites，SCMs），同时将得到的差异代谢物通过代谢通路数据库京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（www.genome.jp/kegg）进行注释解析。

2 结果与分析

2.1 德昂酸茶和普洱熟茶基础成分含量比较分析

表2 德昂酸茶与普洱熟茶基础成分含量Table 2 Chemcial composition of De’ang sour tea and ripe Pu’er tea%

由表2可知，普洱熟茶与德昂酸茶在水浸出物、茶多糖、咖啡碱、游离氨基酸含量无显著差异（＞0.05）；在水分、茶多酚含量存在差异，普洱熟茶水分含量显著高于德昂酸茶，德昂酸茶茶多酚含量显著高于普洱熟茶（＜0.05）。

2.2 代谢物轮廓分析

在正、负离子模式下，应用上述条件检测德昂酸茶和普洱熟茶样品。由图1可知，德昂酸茶和普洱熟茶中代谢物随时间的变化规律。同时，可以明显看出德昂酸茶和普洱熟茶样品的谱图中主要化合物的响应值（强度）存在一些差异，其整体的差异主要表现在峰高和峰面积上，综合分析推测2 种样品之间的差异可能与化合物水平有关。为了揭示德昂酸茶和普洱熟茶的组分差异，进一步采用多维模式识别，对反映样本的多个变量进行观测，以进行较为全面的分析。

图1 德昂酸茶（A）和普洱熟茶（B）样本检测总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatoagrams of De’ang sour tea (A) and ripe Pu’er tea (B) samples

2.3 德昂酸茶与普洱熟茶代谢组学差异分析

2.3.1 PCA

图2 德昂酸茶组对普洱熟茶组PCA得分图Fig. 2 PCA score plot for discrimination between De’ang sour tea (A) and ripe Pu’er tea (B)

2.3.2 OPLS-DA结果

图3 德昂酸茶组对普洱熟茶组的OPLS-DA得分图（a）和置换检验图（b）Fig. 3 OPLS-DA score plot (a) and permutation test plot (b) for De’ang sour tea versus ripe Pu’er tea

2.4 德昂酸茶与普洱熟茶差异代谢物分析

基于OPLS-DA结果，根据VIP值大于1且值小于0.05，得到物质的火山图（图4），寻找潜在的差异物质。综合前面的分析结果，得到最终的差异物质，采用聚类热图（图5）对2 种茶叶中差异物质进行分析。如图5所示，德昂酸茶和普洱熟茶的代谢产物中鉴定出共268 种具有显著差异的代谢物，占所有鉴定代谢物的63.81%，说明德昂酸茶和普洱熟茶之间的代谢物质差异显著。在268 种差异代谢成分中，德昂酸茶有78 种成分相对含量显著高于普洱熟茶，190 种成分相对含量显著低于普洱熟茶。其中差异倍数较大的是氨基酸类、脂肪酸、核苷酸类、有机酸、糖类5 种类别，分别占比为18.28%、14.55%、13.80%、10.82%、6.71%。在所有差异代谢物中，有机酸11 种、氨基酸类11 种、糖类9 种、脂肪酸9 种、核苷酸类6 种、醇类化合物6 种在德昂酸茶中相对含量更高；氨基酸类38 种、脂肪酸30 种、核苷酸类30 种、有机酸18 种、糖类9 种在普洱熟茶中相对含量更高。虽是同一种原料茶但因发酵工序不同，2 种茶在其种类和含量上的差异，形成了各不相同的滋味特征。

研究结果表明，德昂酸茶中相对含量较高的物质包括麦角硫因、3,4-二甲氧基苯乙酸、3-羟基扁桃酸、氯化乙酰胆碱、2-羟基-4-甲基戊酸、米格列醇、-脯氨酸、4,6-二氧代庚酸、丙二醇、原花青素B、-乙酰甘氨酸。主要为氨基酸、有机酸和酚类物质。在普洱熟茶中相对含量较高的物质包括山柰酚-3-芸香糖苷、中康酸、-胸苷、非氨酯、肉叶云香碱、芹菜苷、十六碳二酸、异鼠李素。主要有黄酮类、糖类以及核苷酸类等。

麦角硫因是德昂酸茶中差异倍数值最高的物质，高达88.86。其在德昂酸茶的相对定量均值为3.43×10，在普洱熟茶中相对定量均值为3.86×10，麦角硫因是一种稀有的天然氨基酸类强抗氧化剂，由微生物合成，具有调节炎症，防止紫外线辐射诱导的损伤，保护细胞，预防心血管疾病等作用。目前关于茶叶中麦角硫因研究鲜见报道，其在德昂酸茶中贡献较大，可能与独特的发酵方式有关。作为一种天然抗氧化剂具有广泛的研究前景，在生物体内的作用机制与疾病的关系尚不清楚，仍需进一步的研究探讨。

图4 德昂酸茶组对普洱熟茶组之间化合物的火山图Fig. 4 Volcano map for differential compounds between De’ang sour tea and ripe Pu’er tea

图5 德昂酸茶vs普洱熟茶差异代谢物热图Fig. 5 Heatmap for differential metabolites between De’ang sour tea and ripe Pu’er tea

发现德昂酸茶与普洱熟茶的有机酸、酚类物质差异代谢物能明显区分开。德昂酸茶的3,4-二甲氧基苯乙酸、3-羟基扁桃酸、4,6-二氧代庚酸差异倍数值显著高于普洱熟茶，分别为37.60、19.24、8.81。有机酸是茶叶中一种水溶性化合物，是茶汤香气和呈味物质的重要成分之一。3-羟基扁桃酸作为一种芳香酸，被用作香精香料的原料之一，推测德昂酸茶具有其独特的“酸香”，可能与其有机酸的种类和含量有关。在醇类/酚类物质中，米格列醇、丙二醇、原花青素B值显著差异，分别为12.24、8.23、7.99。米格列醇是一种非天然假糖，已被用作口服降糖剂治疗II型糖尿病。丙二醇是一种食品添加剂，常态下为无色黏稠状液体，近乎无味，细闻发甜，具有保湿、乳化、溶解色素、软化香精香料的作用。原花青素B是一种天然抗氧化剂，不仅可以清除体内过多的自由基，还能抑制脂质过氧化的发生。这些醇类和酚类的共同作用，使德昂酸茶不仅具有独特的风味还具有开胃消食、调节肠道微生物等功能。-脯氨酸、乙酰甘氨酸差异倍数值较高，分别为9.62、7.91。说明其对茶叶滋味的贡献较大，这与前期报道相似，其滋味反映到茶汤中主要表现为鲜爽的口感，对其口感形成扮演着重要角色。

2.5 德昂酸茶与普洱熟茶具有显著性差异代谢物通路的Metpa分析

通过KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析，共检测有57 条通路（图6），在鉴定出来的268 种差异显著的代谢物中，在KEGG中注释到的个数为164 个，其中有114 个差异代谢物显著上调，50 个差异代谢物显著下调，主要分布在47 条代谢途径中（图7）。从图7可发现，普洱熟茶比德昂酸茶的代谢通路更多，更为复杂。而德昂酸茶中，富集程度最高的前5 条通路分别为：1）苯丙氨酸代谢通路（＝0.000 365 18），主要包括-苯丙氨酸化合物、苯基丙酮酸、反式肉桂酸化合物、邻羟基苯乙酸化合物、4-羟基肉桂酸化合物等差异代谢物；2）VB代谢通路（＝0.679 25），主要包括吡哆醛-5-磷酸化合物等差异代谢物；3）异喹啉生物碱生物合成通路（＝0.109 62），主要包括多巴胺化合物、酪胺化合物等差异代谢物；4）硫胺素代谢通路（＝0.293 34），主要包括-半胱氨酸化合物、磷硫胺化合物等差异代谢物；5）酪氨酸代谢（＝0.254 62），主要包括尿黑酸化合物、对羟基苯乙胺化合物、2-(3,4-二羟基苯基)乙胺化合物等差异代谢物。

由图7可知，氨基酸类物质参与苯丙氨酸代谢、硫胺素代谢通路、酪氨酸代谢、氨基酸生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢等多条通路，被KEGG注释到的有21 种，其中有6 种显著上调，是2 种茶叶的代谢物中重要的部分，对其风味和品质有着密切关系。德昂酸茶中的-色氨酸、-苯丙氨酸、-脯氨酸等都在德昂酸茶中显著上调。其中，-脯氨酸味微甜；-色氨酸，-苯丙氨酸味微苦，后者属于芳香族氨基酸，可与糖类起氨基-羰基反应，改善食品的香味。茶叶中的氨基酸种类十分丰富，其含量是决定茶叶滋味浓醇鲜爽的重要因素，发现不同的加工方法对茶的氨基酸含量变化具有一定的影响，德昂酸酸滋味形成主要靠其长达9 个月的微生物发酵，以上这些氨基酸物质的相互作用可能是形成德昂酸茶优良的品质和滋味特征的原因。

图6 德昂酸茶和普洱熟茶差异物质的代谢通路富集分析Fig. 6 Enrichment analysis of metabolic pathways of differential metabolites in De’ang sour tea versus ripe Pu’er tea

图7 德昂酸茶（中线右侧）和普洱熟茶（中线左侧）差异物质的丰度评分分析Fig. 7 Abundance score analysis of differential metabolites in De’ang sour tea versus ripe Pu’er tea

3 讨论与结论

本研究结果表明德昂酸茶和普洱熟茶的水浸出物、茶多糖、咖啡碱、游离氨基酸含量上无显著差异；但在水分和茶多酚之间出现。应用非靶向代谢组学方法对德昂酸茶和普洱熟茶的小分子物质二级质谱数据进行差异性分析。以VIP值大于1且值小于0.05为指标，检测出17 类268 种显著性差异代谢产物，占所有代谢物的63.81%，主要包括氨基酸类49 种、脂肪酸39 种、核苷酸类36 种、有机酸29 种、糖类18 种，并发现德昂酸茶中相对含量较高的主要差异代谢物是氨基酸/糖类，普洱熟茶相对含量较高的主要差异代谢物是氨基酸类。通过VIP值和值，进一步筛选到麦角硫因、3,4-二甲氧基苯乙酸、3-羟基扁桃酸、氯化乙酰胆碱、2-羟基-4-甲基戊酸、米格列醇、-脯氨酸、4,6-二氧代庚酸、丙二醇、原花青素B、-乙酰甘氨酸等差异代谢产物对于不同发酵工艺的茶叶不同滋味品质形成可能具有重要贡献。KEGG代谢通路分析发现，德昂酸茶和普洱熟茶的氨基酸和核苷酸类物质代谢水平具有显著差异，涉及氨基酸代谢和核苷酸类代谢相关的通路对不同发酵工艺的茶叶的滋味品质有着重要影响。

本研究建立了基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术的非靶向代谢组学方法，该模型可以将德昂酸茶和普洱熟茶彼此区分。对德昂酸茶和普洱熟茶进行鉴定比较，该方法具有良好的重复性和精密度，所检测到的物质可为德昂酸茶分析及相应的生物学功能研究提供一定的数据支持。