白术、茯苓和珍珠不同配比的美白功能评价*

黄惠珠，恽 昊，温博栋，张海容

(1 广州华商职业学院健康医学院，广东 广州 511399；2 广州威溶特医药科技有限公司，广东 广州 510670；3 广州华商学院，广东 广州 511399)

近年来，随着大家对皮肤表面审美要求的提高，美白类化妆品受到越来越多东方女性的青睐。除此之外，在西方国家，美白产品被应用于无规律色素过度沉着的预防和治疗中，如老年斑、雀斑等[1]。美白产品以抑制黑色素生成为主要途径，黑色素生物合成的关键限速酶是酪氨酸酶，抑制酪氨酸酶的含量可以有效地限制黑色素的合成。随着人们对美白类化妆品的质量和安全的日益重视，探寻合适的酪氨酸酶抑制剂在美白化妆品的研究开发中具有重要作用和良好的前景。

众多研究表明，中药作为现代化妆品中的原料，以其来源于大自然、对皮肤作用温和、往往兼具营养和药效双重作用、使用安全放心等特点，在追崇安全、绿色、健康的时代中，越来越受到广大消费者的青眯[1]。

美白药物的筛选实验最常用的是酪氨酸酶活性抑制实验，其方法成熟，结果可靠[2]。笔者寻经问典，从古人的智慧与经验中，针对黑色素沉淀的皮肤问题，找寻合适的中药加以配伍并进行体外药效评价。以往研究发现，白术、茯苓、珍珠均对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，但三药配伍对酪氨酸酶活性的抑制作用未曾被报导，故本研究针对三药配伍的不同配比进行体外研究，利用酪氨酸酶活性抑制实验，观察白术-茯苓-珍珠三药配伍的美白功效，为后期中药美白化妆品的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

维生素C(色谱纯，O19EB100374),上海源叶生物科技有限公司；α-熊果苷(色谱纯，Y07D6C7197),上海源叶生物科技有限公司；酪氨酸酶(25 kU，E815BD0304)，生工生物工程(上海)股份有限公司；酪氨酸酶活性检测试剂盒(1012109282)南京碧波生物科技发展有限公司；乙醇为分析纯级，用水为纯水；白术、珍珠、茯苓饮片,购于广东瑞年大药房，由张海容教授进行性状鉴定,符合《中华人民共和国药典》规定的基源。

1.2 仪器设备

722型可见分光光度计,上海解谱仪器有限公司;BSA224S型万分之一电子天平,北京赛多利斯天平有限公司;KQ3200DE型超声清洗仪,昆山市超声仪器公司。

1.3 供试液的制备

本次实验共设2个阳性对照组(维生素C、α-熊果苷)、9个样品组，分别为白术组、茯苓组、珍珠组、白术-茯苓-珍珠6个不同配比组1:1:1、1:2:1、1:3:1、2:2:1、2:4:1、2:6:1。

维生素C、α-熊果苷分别加纯水配制成浓度为4 mg/mL的供试液；白术、茯苓、珍珠饮片粉碎，过80目筛后备用。按比例称取各组样品，单药组各称1.0 g、配比组按比例(比例1即称取相应药材粉末1.0 g，比例2即称取相应药材粉末2.0 g，以此类推)进行称量。分别选用三种不同极性的溶剂(纯水、75%乙醇、无水乙醇)进行提取超声提取，物料比为1:15,超声30 min后过滤，滤渣再按上述方法进行提取，合并2次滤液，制成33.33 mg/mL的供试液原液，原液稀释成10 mg/mL作为酪氨酸酶抑制试验测试液。

1.4 溶液配制

酪氨酸酶溶液：25 kU酪氨酸酶粉末加入纯水12.5 mL，配制成2000 U/mL。酪氨酸酶活性抑制试验所需要的其他溶液，按照酪氨酸酶活性检测试剂盒说明书要求进行配制。

1.5 酪氨酸酶活性抑制实验

(1)待测液按照以下设置进行加样，置于5 mL离心管中备用。空白组：50 μL纯水+50μL酪氨酸酶溶液；阳性对照组：50 μL维生素C溶液+50 μL酪氨酸酶溶液、50 μL α-熊果苷溶液+50 μL酪氨酸酶溶液；纯水提取组：50 μL供试液+50 μL酪氨酸酶溶液；75%乙醇提取组：50 μL供试液+50 μL酪氨酸酶溶液；无水乙醇提取组：50 μL供试液+50 μL酪氨酸酶溶液。

(2)按照试剂盒的使用方法进行检测。分光光度计预热30 min后，调节波长至475 nm，纯水调零，往上述待测液中加入900 μL试剂一(主要成分是能与酪氨酸酶反应的底物)，立即开始计时，测定10 s(总时间)时475 nm处的吸光值；置于常温下继续反应180 s，测定190 s(总时间)时475 nm处的吸光值；每组供试液测试5次进行数据分析。酪氨酸酶的抑制率按照以下公式计算：

式中：A为空白组10 s(总时间)时475 nm处的吸光值；B为空白组190 s(总时间)时475 nm处的吸光值；C为供试液组10 s(总时间)时475 nm处的吸光值；D为供试液组10 s(总时间)时475 nm处的吸光值。

2 结 果

阳性对照组(维生素C、α-熊果苷)、9个样品组，分别用纯水、75%乙醇、无水乙醇提取后所得供试液，合计30组供试液对酪氨酸酶活性抑制率的结果，见表1所示。

表1 不同溶剂下样品组对酪氨酸酶活性的抑制率比较

从表1可得，与空白对照组相比，阳性对照组、纯水提取组、75%乙醇提取组、无水乙醇提取组所有供试液均对酪氨酸酶活性有抑制作用(p<0.01)。其中，维生素C组抑制率高达96.57%，α-熊果苷也达到57.67%。

纯水提取组中除白术组以外，其他组的抑制率均高于α-熊果苷对照组。但均低于维生素C对照组的抑制水平。其中抑制率最佳的是白术-茯苓-珍珠(2:6:1)组(81.46%)，其次为白术-茯苓-珍珠(1:3:1)组(79.41%)。

75%乙醇提取的9个样品组的抑制率均高于α-熊果苷对照组，除白术-茯苓-珍珠(2:6:1)组的抑制率略高于维生素C对照组外，其余均低于维生素C对照组的抑制水平。其中抑制率最佳的是白术-茯苓-珍珠(2:6:1)组(97.14%)，其次为白术-茯苓-珍珠(2:4:1)组(92.85%)，白术-茯苓-珍珠(1:3:1)组(90.56%)。

无水乙醇提取组的9个样品组的抑制率均高于α-熊果苷对照组，但均低于维生素C对照组的抑制水平。抑制率最佳的是白术-茯苓-珍珠(2:6:1)组(88.56%)，其次为白术-茯苓-珍珠(1:3:1)组(82.28%)。

样品组相同原料、相同配比、不同提取溶剂的情况下，酪氨酸酶抑制率存在一定的差异,抑制率从高到低为75%乙醇提取组>无水乙醇提取组>纯水提取组。

3 讨 论

皮肤正常所呈现的颜色是多种生物色素不同分布共同作用的结果，与光线折射以及皮肤厚度也有一定的关系，通常情况下黑色素在其中起主要作用[3]。酪氨酸酶是一种含铜离子的金属酶，属于多酚氧化酶，是在动植物及微生物体内广泛存在的酶，是黑色素生成过程中一系列化学反应的限速酶。许多化妆品美白剂可以通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素生成，从而发挥美白肌肤的作用[4]。酪氨酸酶活性抑制试验是美白功效评价的经典实验，酪氨酸酶底物如单酚类底物酪氨酸或双酚类底物左旋多巴(levodopa, L-DOPA)可在酪氨酸酶的催化下生成多巴色素，多巴色素具有一定的吸光性，可通过测定吸光度来评估酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶抑制剂可抑制酪氨酸酶的活性，从而减少多巴色素的生成。因此，根据多巴色素含量的多少可评估酪氨酸酶的活性，从而推算出待测物对酪氨酸酶的抑制率[5]。运用分光光度计或酶标仪直接测定吸光度进行酪氨酸酶抑制剂筛选的方法，操作简单，因此广泛用于中药提取物中酪氨酸酶抑制剂的初步筛选或已知成分对酪氨酸酶抑制能力的验证。

本次研究运用超声提取法，利用空化效应、机械效应和热效应。当达到一定能量的超声波作用于介质，介质被撕裂成很多小空穴，在一系列动力学过程产生空化效应，超声空化会产生巨大的压力，使整个生物体破裂瞬间完成，缩短了破碎时间，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率[6]。维生素C又被称为L-抗坏血酸，对皮肤有很多有益的作用，包括抗氧化、抗衰老和美白作用。医学研究表明人类不能合成维生素C，大量口服皮肤中维生素C对皮肤中含量的增加也是极其有限，因此维生素C局部应用是增加皮肤浓度的唯一办法，维生素C也成为美白化妆品的添加成分之一[6]。熊果苷是一种从熊果植物中分离的天然多酚，抑制黑色素的生成，可以促进B16黑色素瘤细胞凋亡，研究结果表明熊果苷可以作为皮肤美白的有效成分之一[7]。熊果苷具有两种异构体，包括α-熊果苷和β-熊果苷，研究表明α-熊果苷的功效是天然熊果苷的10倍[8]。因此，本次实验研究选取维生素C和α-熊果苷作为阳性对照。根据本次研究的结果可以看出，阳性对照组维生素C与α-熊果苷在相同浓度(4 mg/mL)下维生素 C 的抑制作用更强，与张国哲的实验结果[2]类似。

经文献记载，白术中含有的活性成分白术多酚对细胞内黑色素合成和酪氨酸酶活性均有不同的抑制作用[9]，茯苓的有效成分总三萜和茯苓新酸A对酪氨酸酶均呈现明显的抑制作用，对小鼠黑色素瘤细胞存在一定的细胞毒性[10]，珍珠提取物富含的多肽成分可以在保证细胞安全生长的基础上抑制黑色素的生成，并且在高浓度下通过抑制酪氨酸酶控制细胞内黑色素的含量[11],上述三种药物均对酪氨酸酶的活性有一定的抑制作用。本研究中，不同溶剂提取的单体组白术、茯苓、珍珠对酪氨酸酶的活性均有较强的抑制作用，与张建华、沈喆鸾、杨安全等的实验结果[6,11-13]类似。在同等浓度下，不同溶剂提取的单体组抑制率从高到低依次为茯苓>珍珠>白术，说明同浓度下茯苓对酪氨酸酶的活性抑制作用最强，美白效果最佳。

在三药的不同配比组中，珍珠的量固定为1，一是因为珍珠相对于前两者来说价格较高，二是珍珠在超声提取的工艺下，对酪氨酸酶活性的抑制作用不如白术和茯苓。三药的不同配比在固定白术和珍珠为1时，随着茯苓的量占比的提高，抑制率也随着变高。这和石成方[14]、邓燕[15]、王雪梅[16]的结果相一致，高浓度的茯苓提取物对酪氨酸酶的活性的抑制率更高。三药的不同配比在固定白术和珍珠为2:1时，发现其比白术和珍珠为1:1时的抑制率更高，这是因为白术提取物的高中低三个浓度对酪氨酸酶活性均有抑制作用，且高浓度抑制作用最强，美白效果更佳[17]。

综合表1的结果，可以看出三药6个不同配比的不同溶剂提取物，抑制率最佳的配比均为白术-茯苓-珍珠2:6:1，其次为纯水提取组1:3:1,75%乙醇提取组2:4:1，无水乙醇提取组1:3:1。水提法适用于提取水溶性的成分，醇提法适用于提取有机成分，样品组在同原料、同配比、不同提取溶剂的情况下，酪氨酸酶抑制率从高到低为75%乙醇提取组>无水乙醇提取组>纯水提取组，可能是三药的美白成分除总三萜类、多酚、多肽等有机有效成分之外，还有一部分为水溶性成分，在75%乙醇中的有效成分总溶解度更高所致。

三药的6个不同配比组和单体组相比，除了1:1:1这一配比外，其他配比均高于任一单体组，说明三药配伍对酪氨酸酶活性的抑制作用更强，其中以75%乙醇提取组2:6:1最佳，与阳性对照组维生素C无显著性差异，且效果更佳。

4 结 论

通过对白术、茯苓、珍珠及三药的6个不同配比组分别用纯水提取、75%乙醇提取、无水乙醇提取后所得的溶液进行酪氨酸酶抑制率的测定，组间对比后可知75%乙醇提取的白术-茯苓-珍珠2:6:1配比组对酪氨酸酶的抑制率最高，美白效果最佳。

据调查显示：80%的亚洲女性希望自己的肌肤白皙莹润，70%的欧美女性利用功能性美白产品来减轻或消除色斑[4,18]。权威市场研究公司尼尔森分析指出，在中国护肤品市场，有近30%的化妆品属于美白类产品[19]。

维生素C作为天然活性成分,具有很高的抗氧化性能,以及具有美白祛斑、强健肌肤、促进胶原蛋白合成等功效,广泛应用于护肤领域。维生素C具有稳定性差,对温度、光、氧、金属离子等具有很强的敏感性且其皮肤吸收能力差等缺陷,限制了维生素C的功效发挥[20]。

虽然α-熊果苷高浓度对酪氨酸酶活性抑制率能达到90%以上(受浓度的影响)，且在非紫外光条件下(日照光)使用较为安全，但α-熊果苷的化学合成尚未有高效立体专一性的合成方法，目前主要是酶合成法和生物转化法，故价格昂贵(4000～8000元/kg)[21-23]。并且α-熊果苷的使用环境有所限制，故笔者认为来源更广、更廉价、效果更优(相较于浓度为4 mg/mL的α-熊果苷)的白术-茯苓-珍珠组合更具市场优势。将来可将此配方制成适宜的剂型，并进行透皮吸收、皮肤致敏等方面的研究，为进一步开发成美白产品提供实验支持。