龈沟液OPG、IL-35、IL-37在慢性牙周炎中的表达及与牙槽骨吸收的相关性

刘晓燕，耿文华，杜莎莎，刘英奇

(河北省邯郸市中心医院口腔科，河北 邯郸 056000)

慢性牙周炎是长期存在的牙龈炎逐渐向牙周组织深部扩张所致的一种口腔疾病[1]。全国流行病学调查显示，30岁以上群体中约90%患有不同程度牙周疾病，其中以慢性牙周炎最为常见，占比超70%[2-3]。牙槽骨吸收属牙周炎重要病理变化，正常情况下，牙槽骨吸收与新生维持平衡状态，牙槽骨高度恒定，但受牙周炎症影响，若骨吸收增加和(或)骨新生降低并存时即出现骨丧失致牙齿支持组织丧失，牙齿松动，最终拔除或脱落[4]。近年有关牙槽骨吸收的治疗主要从牙周治疗、控制局部炎症和菌斑等方面入手，但此疾病病机复杂，尤其是30岁以上群体，除与局部炎症、免疫有关外，还可能与骨流失有关[5-6]。因此，积极明确牙槽骨吸收相关生化过程对完善干预方案至关重要。核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)是骨形成及吸收耦联的关键环节，而骨保护素(osteoptegerin，OPG)是RANKL引诱受体，其水平变化可直接影响骨代谢[7]。白细胞介素(interleukin，IL)-35、IL-37是近年新发现的与免疫、炎症有关白细胞介素家族成员，其水平变化与多种炎性疾病有关[8-9]。但慢性牙周炎患者龈沟液OPG、IL-35、IL-37水平及与牙槽骨吸收间关系如何鲜见报道，本研究对此探讨，旨在为临床进一步探明牙槽骨吸收病理生理机制提供参考。报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年12月—2021年10月慢性牙周炎患者105例作为试验组，再选取同期慢性牙周炎患者45例作为验证组，同期健康体检者105例为对照组。试验组男性59例，女性46例，年龄28～69岁，平均(47.98±8.44)岁；体重指数17～26 ，平均22.06±1.68；慢性牙周炎病程1～7年，平均(3.56±1.08)年；吸烟情况：每日吸烟20例，偶尔吸烟16例，从不吸烟或已戒69例；饮酒情况：过度饮酒19例，适度饮酒34例，从不饮酒或已戒52例。验证组男性27例，女性18例，年龄26～68岁，平均(48.35±7.22)岁；体重指数17～26，平均21.89±1.53；慢性牙周炎病程1～8年，平均(3.41±1.03)年；吸烟情况：每日吸烟9例，偶尔吸烟7例，从不吸烟或已戒29例；饮酒情况：过度饮酒9例，适度饮酒13例，从不饮酒或已戒23例。对照组男性63例，女性42例，年龄27～70岁，平均(48.72±7.36)岁；体重指数17～28，平均21.93±1.41；吸烟情况：每日吸烟22例，偶尔吸烟15例，从不吸烟或已戒68例；饮酒情况：过度饮酒16例，适度饮酒38例，从不饮酒或已戒51例。3组性别、年龄、体重指数、吸烟情况、饮酒情况差异无统计学意义(P>0.05)，试验组和验证组慢性牙周炎病程差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：①试验组、验证组符合慢性牙周炎诊断标准[10]；②全口保留牙≥18颗；③无急性牙龈乳头炎、龈缘炎等其他牙周疾病；④无严重全身系统性疾病；⑤无长期抗生素应用史；⑥对照组全身健康；⑦知情本研究内容，签署同意书。排除标准：①哺乳及妊娠期女性；②正接受正畸治疗者；③入组前3个月内有急慢性感染性疾病史。

本研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2方法

1.2.1龈沟液OPG、IL-35、IL-37检测 将患牙、牙龈吹干并隔湿，取已备好EP管内滤纸条插进待测牙近中位牙周袋底，留置60 s，若沾染血则弃除，3 min后再插入1条滤纸条，留置60 s，再3 min插入第3条滤纸条。3滤纸条置入相同EP管称重，按1 g/L换算体积，EP管内加PBS液200 μL，封口，置液氮保存待测。测时取出样本，室温解冻，振荡器振荡10 min，超声振荡1 h，离心10 min(4 ℃，3 000 r/min，半径8 cm)，收集上清液，采用上海晶抗生物工程有限公司酶联免疫试剂盒检测OPG、IL-35、IL-37水平，严格参照试剂盒说明书步骤进行操作。酶标仪在450 nm波长下测样本光密度值，参照标准曲线获得OPG、IL-35、IL-37水平值。

1.2.2牙槽骨吸收检测 采用平行投照技术拍摄数码根尖片，拍摄条件为70 kV，12 V，20 mA。拍摄后采用自带医学影像信息系统的测量工具同一牙位牙槽骨破坏区域水平向最大距离、垂直向最大距离。

1.3观察指标 ①比较试验组和对照组龈沟液OPG、IL-35、IL-37水平；②比较试验组不同临床特征患者牙槽骨吸收比例；③分析试验组牙槽骨吸收比例的影响因素，并建立多元线性回归模型；④组外验证。

1.4统计学方法 应用SPSS 25.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验。计量资料比较采用t检验、单因素方差分析和LSD-t检验。采用多元线性回归模型分析牙槽骨吸收比例的影响因素，并绘制回归方程评估牙槽骨吸收比例与实际检测值的散点图，求出平均绝对偏差(mean absolute deviation，MAD)值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1试验组和对照组龈沟液OPG、IL-35、IL-37比较 试验组龈沟液OPG、IL-37水平低于对照组，IL-35水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 试验组和对照组龈沟液OPG、IL-35、IL-37比较Table 1 Comparison of OPG, IL-35 and IL-37 in gingival crevicular fluid of experimental group and control group

2.2试验组不同临床特征患者牙槽骨吸收比例比较 105例患者牙槽骨吸收比例为(20.06±6.56)%。不同年龄、病程、牙齿数量、病情程度、吸烟情况、定期口腔检查、维生素D缺乏、合并糖尿病、龈沟液OPG、IL-35、IL-37水平患者牙槽骨吸收比例差异有统计学意义(P<0.05)。不同性别、体重指数、饮酒情况、定期洗牙、不良修复体、偏侧咀嚼、偏好甜食、刷牙频次、每次刷牙时间、刷牙方式、牙线使用频次、口腔疾病史、营养不良、维生素C缺乏、合并高血压、合并高症血症、合并骨质疏松患者牙槽骨吸收比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 试验组不同临床特征患者牙槽骨吸收比例比较Table 2 Comparison of the proportion of alveolar bone resorption in patients with different clinical characteristics of the experimental group

表2 (续)

2.3多元线性回归分析 以患者牙槽骨吸收比例作为因变量，以表2中差异有统计学意义的项目为自变量，进行多元线性回归分析，结果显示，龈沟液OPG、IL-35、IL-37水平是牙槽骨吸收比例的影响因素(P<0.05)。建立回归模型为：牙槽骨吸收比例=6.495-0.180×OPG+0.169×IL-35-0.055×IL-37，差异有统计学意义(P<0.05)。自变量可解释牙槽骨吸收比例91.5%的变异量。见表3，4。

表3 变量赋值表Table 3 Variable assignment table

表4 多元线性回归分析Table 4 Multiple linear regression analysis

表4 (续)

2.4组外验证 采用验证组45例患者龈沟液OPG、IL-35、IL-37水平对回归模型进行验证，其MAD值为1.25%。见图1。

图1 组外验证散点图

3 讨 论

牙槽骨吸收是在牙周炎长期刺激下造成骨吸收/骨形成平衡偏移而出现的一种病理性改变[11]。慢性牙周炎发病机制十分复杂，涉及骨吸收、骨重建及免疫炎症等多个过程，造成此疾病极易反复，而进一步了解其病理机制相关生化信息是指导临床完善治疗方案的关键环节。

临床证实，牙周炎整个病程中牙槽骨吸收与成骨细胞活力下降、破骨细胞活力及胶原水解活性增加关系密切[12]。OPG是肿瘤坏死因子家族主要成员之一，其由成骨细胞生成并分泌，主要生理作用是通过与RANKL竞争性结合破骨细胞表面RANKL受体以抑制破骨细胞激活[13-14]。本研究发现，慢性牙周炎患者龈沟液内OPG水平显著低于健康群体，由此说明慢性牙周炎病情进展可能与OPG水平变化有关。但近年较多研究指出，慢性牙周炎患者牙周状况是多种因素互相和(或)共同作用的结果，维生素D缺乏、合并糖尿病、慢性牙周炎病情中/重度等均可能造成或促进牙槽骨吸收[15-16]。本研究结果显示，不同年龄、病程、牙齿数量、吸烟情况、维生素D缺乏患者牙槽骨吸收比例差异有统计学意义，与上述研究存在一定异同，同时也说明慢性牙周炎发生发展病机的复杂性。此外，OPG低表达患者牙槽骨吸收更严重(平均值达21.71%)。分析此机制可能是：①OPG是成骨细胞生成的唯一一种破骨细胞负向调节因子，可作用于破骨细胞分化末期，抑制破骨细胞前体细胞分化及诱导破骨细胞凋亡继而促使骨平衡向骨形成一方偏移[17]。②RANKL是一种骨吸收重要细胞因子，其在体外可诱使形成破骨细胞，在体内可促使破骨细胞成熟，而OPG能特异性与RANKL结合，通过抑制其诱导破骨细胞形成及成熟等过程，促进骨形成[18]。因此，当慢性牙周炎患者龈沟液OPG低表达时可能会因骨新生迟缓，而骨吸收活跃最终出现牙槽骨吸收的病理性改变。继续多元线性回归分析发现，龈沟液OPG升高有助于预防牙槽骨吸收。

另外，龈沟液OPG水平受免疫、炎性多种因素影响[19]，同时研究证实，免疫及炎性改变既是慢性牙周炎发生发展的病理生理特征，又是其发生发展的促进因子[20]。IL-35、IL-37是近年研究热点，认为二者与多种免疫及感染性疾病有关[21]。IL-35是Treg分泌的一种炎症抑制性细胞因子；IL-37是IL-1家族新成员，但与其他成员不同的是，其既是一种抗炎因子，又兼具免疫抑制作用。有研究表明，牙周组织受微生物感染时龈沟液IL-37水平降低，治疗后其水平回升[22]。本研究结果显示，慢性牙周炎患者龈沟液IL-37水平降低，IL-35水平升高。但IL-35、IL-37同作为免疫、炎症相关因子，表达趋势相反的机制可能是慢性牙周炎大量生成促炎因子时，IL-37作为重要抗炎因子，其被Treg分泌后便与靶细胞上受体结合并移位至细胞质，通过调节信号通路磷酸激酶激活状态而发挥抗炎作用，造成释放入龈沟液内的水平下降，而IL-35具有独特的炎性免疫抑制活性，其不仅能调节细胞周期停滞，阻滞Treg细胞增殖，同时IL-35与iTreg间存在正反馈调节作用，可通过促进iTreg分化生成Treg细胞而大量分泌IL-35。因此，当慢性牙周炎发生发展时，龈沟液IL-35、IL-37表达并不一致。进一步建立多元线性回归模型发现，龈沟液OPG、IL-35、IL-37是牙槽骨吸收比例的影响因素。但本研究不足之处在于龈沟液取样本身影响因素很多，生活习惯、口腔卫生、合并基础疾病等虽然能一定程度上减少混杂因素影响，但仍无法完全，如何进一步提高研究准确性可作为今后研究方向。

综上所述，慢性牙周炎患者龈沟液OPG、IL-37低表达及IL-35高表达均会加剧牙槽骨吸收。